肺癌组织中EGFR 19、21外显子基因突变丰度的荧光偏振检测研究

发布时间：2017-10-12 00:13

  本文关键词：肺癌组织中EGFR 19、21外显子基因突变丰度的荧光偏振检测研究

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【摘要】：【背景】肺癌是全球男性死亡率最高的肿瘤,并且,在发达国家女性中,肺癌已超过乳腺癌,成为女性死亡的第一大肿瘤。人表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向治疗药物(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是针对肺癌中EGFR及其信号通路的小分子阻断剂,是一种化学合成的靶向治疗药物,在非小细胞肺癌特别是腺癌EGFR敏感突变者中疗效显著,已被批准单药治疗作为复发转移性晚期非小细胞型肺癌的二、三线治疗或一线治疗。然而,近年来对EGFR-TKIs耐药及疗效差异性的报道屡见不鲜,此类药物的敏感及耐药相关因素也逐渐被发现,并用于筛选更加适合的患者。但是,在临床中尽管一些患者含有EGFR敏感突变,却也对EGFR-TKIs的疗效较差。我们基于这一现象提出假设:肿瘤内是否存在基因突变丰度的异质性,并可能造成靶向治疗的疗效差异?荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)是一种高灵敏度的荧光标记检测方法,可检测不同波长的荧光强度值,结合探针的靶向结合特性因而特别适用于基因突变的检测。目前,大多数EGFR基因突变检测技术未能检测瘤内基因突变丰度,因此不能全面评估瘤内突变丰度的信息,为此我们基于荧光偏振技术在基因突变检测方面的优势,初步设计并建立了一种检测肺癌标本中EGFR基因敏感突变丰度的检测方法以便为临床预测靶向药物的疗效以及制定合理的治疗策略提供依据。【目的】建立一种快速、灵敏、特异的基于荧光偏振技术的检测体系和方法,并将该方法用于检测肺癌标本中EGFR 19、21外显子的基因突变丰度,以期全面准确地预测靶向药物个体化使用。另外,对接受吉非替尼治疗的患者进行随访,统计缓解率与生存期,进一步证明EGFR基因突变丰度对吉非替尼药物疗效与预后的预测价值。【方法】第一部分,建立荧光偏振检测的标准体系。首先,提取含有EGFR 19、21外显子突变型与EGFR 19、21外显子野生型患者的全基因组DNA,设计引物,特异的荧光标记探针。然后,分别构建EGFR 19、21外显子野生型与EGFR 19、21外显子突变型的4种重组质粒标准品。最后,经过荧光偏振PCR反应,得出扩增产物并使用荧光偏振仪检测反应液的偏振值(FP)。根据FP值与相应标准品质粒的拷贝数绘制曲线图,进而根据曲线的线性趋势得出直线方程。再经过稳定性,特异性,灵敏性的验证后即作为后续实验的定量标准。第二部分,将建立好的标准体系和方法应用于临床肺癌病理标本中EGFR19、21外显子基因突变丰度的检测,并将患者的DNA经普通PCR扩增EGFR19、21外显子目的序列后,送测序,将两种检测方法的结果进行比较,验证本法的准确性。并对接受吉非替尼靶向治疗的58例患者进行疗效和生存期的随访,运用统计学方法分析其与EGFR19、21外显子基因突变丰度大小的关系,再次对该检测方法的实用价值及有效性进行验证。【结果】本研究所建立的标准体系经过全面验证,具有稳定性好,灵敏性高,特异性强的优点。该方法最低检测浓度为40拷贝/ul,最低可检测的EGFR基因突变丰度大小为10%。该方法对标本是否含有突变的检测结果和直接测序法检测结果相一致。将受试者的突变丰度与其接受吉非替尼的药物疗效以及生存期进行统计学分析,发现基因突变丰度高者比低者对靶向药物反应性好,并且至疾病进展时间(TTP)与总生存期(OS)具有差异性,并且差异具有统计学意义(p0.05)。【结论】荧光偏振(FP)检测技术与PCR技术相结合可用于基因突变及其突变丰度的检测,并且有操作便捷、特异性强、灵敏度较高、可提供全面的瘤内异质性分析等优势。我们研究并建立了一种检测非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中EGFR基因突变丰度的新方法,将为指导肺癌个体化治疗提供良好的检测技术平台。
【关键词】：荧光偏振检测 肺癌 表皮生长因子受体 突变丰度
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-28
• 第一部分EGFR 19、21外显子基因突变拷贝数荧光偏振检测标准体系的建立28-45
• 1 实验材料28-31
• 1.1 主要实验仪器28-29
• 1.2 主要购买试剂29
• 1.3 主要配制试剂29-31
• 2 实验步骤31-38
• 2.1 设计引物与探针31
• 2.2 EGFR 19、21外显子野生型与突变型标准品的构建31-36
• 2.3 荧光偏振检测PCR反应体系的初步建立36-37
• 2.4 荧光偏振检测标准体系的建立与优化37
• 2.5 验证荧光偏振检测标准体系的敏感性37
• 2.6 验证荧光偏振检测标准体系的稳定性37-38
• 2.7 验证荧光偏振检测标准体系的特异性38
• 2.8 统计分析检测结果38
• 3 结果38-43
• 3.1 重组质粒标准品的验证38-39
• 3.2 琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的变化趋势39-40
• 3.3 反应体系的优化40-41
• 3.4 荧光偏振值与模板拷贝数关系的曲线趋势图41-42
• 3.5 荧光偏振检测反应标准体系的灵敏度分析42
• 3.6 荧光偏振检测反应标准体系的稳定性分析42
• 3.7 荧光偏振检测反应标准体系的特异性分析42-43
• 4 讨论43-45
• 第二部分 非小细胞肺癌临床标本中EGFR基因突变丰度的检测45-57
• 1 实验材料45-47
• 1.1 实验仪器及设备45-46
• 1.2 购买试剂46
• 1.3 配制试剂46-47
• 2 实验方法47-50
• 2.1 收集患者标本与资料47
• 2.2 设计引物与探针47-48
• 2.3 标本DNA提取48
• 2.4 标本荧光偏振PCR与基因突变丰度的检测48-49
• 2.5 直接测序法验证标本EGFR基因突变49
• 2.6 统计分析随访资料49-50
• 3 结果50-55
• 3.1 整理患者临床资料50
• 3.2 PCR产物片段大小验证50-51
• 3.3 标本荧光偏振PCR与基因突变丰度的检测51
• 3.4 直接测序结果与荧光偏振检测结果的比较51-53
• 3.5 疗效与生存分析53-55
• 4 讨论55-57
• 小结57-58
• 参考文献58-65
• 个人简历和研究成果65-66
• 致谢66

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本文编号：1015569