siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞Notch1基因沉默作用的研究

发布时间：2017-10-12 06:27

  本文关键词：siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞Notch1基因沉默作用的研究

  更多相关文章： 基因载体 DMAPA-CHEMS 阳离子脂质体 基因转染 基因沉默

【摘要】：目的本文利用基因干扰技术来抑制人卵巢癌SKOV3细胞Notch1基因的表达,在细胞水平上进行Notch1基因敲除效率的评估。虽然基因干扰技术有着巨大的潜力,然而,siRNA易降解的特性限制其临床应用,并且siRNA递送系统仍然存在着诸多缺陷,如转染效率低、稳定性差等问题。所以,设计高效、稳定、安全的Notch1 siRNA载药系统对增强抗卵巢癌作用具有非常重要的意义。本文合成N-(N,N’-二甲基)丙基丁二酸单胆固醇酯单酰胺(DMAPA-CHEMS)阳离子胆固醇材料,合用大豆卵磷脂S100制备阳离子脂质体,并对其制剂学特征,在核酸酶和血清中的稳定性,细胞毒性,细胞摄取效率,Notch1 mRNA沉默和Notch1蛋白下调效率,增殖和凋亡方面进行了评价,为构建安全有效的siRNA载体系统提供了强有力的理论基础。方法利用胆固醇、丁二酸酐、N,N-二甲基丙二胺(DMAPA)、DCC和NHS合成DMAPA-CHEMS,与大豆磷脂S100采用薄膜法制备阳离子脂质体。利用动态激光散射仪(DLS)测DMAPA-CHEMS阳离子脂质体粒径和电位,透射电镜观察形态。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析脂质体在0.1mg/mL RNase和25% FBS环境中对siRNA保护作用。采用 CCK-8试剂盒考察了DMAPA-CHEMS阳离子脂质体和N,C-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物细胞毒性,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察了SKOV3对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的摄取,利用荧光定量PCR和Western Blot评价了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对Notch1基因的沉默效率。最后采用CCK-8试剂盒考查了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞增殖的影响,细胞凋亡试剂盒测定Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞凋亡的影响。结果siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的粒径随N/P比增加而减小。N/P=100时,粒径(100.94±3.72)nm,电位(46.54±4.32)mV。透射电镜显示其为圆形或类圆形。RNase和血清稳定性试验中,可以看到载体可以显著提高siRNA稳定性。流式细胞仪结果显示随N/P比增加,细胞摄取增加,N/P=100时,摄取达到最大值。激光共聚焦显微镜结果显示SKOV3细胞对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物摄取效率高。荧光定量PCR结果表明N/P=100时,对SKOV3细胞Notchl mRNA表达抑制最大,其2-△△Ct为0.34±0.04,明显低于空白组0.944-0.07。Western Blot结果显示转染Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS日离子脂质体复合物24小时后即可见SKOV3细胞Notchl蛋白表达明显下调,转染72 h后蛋白表达为(26.47±6.23)%,显著低于对照组(100.00±11.02)%。CCK-8试剂盒检测细胞毒性实验可以看到DMAPA-CHEMS日离子脂质体的细胞毒性较小,浓度100μg/mL时,转染后24 h、48 h或72 h,细胞存活率都高于80%。结果表明,DMAPA-CHEMS阳离子脂质体作为基因运送载体,本身并无明显的细胞毒性,但是Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞的增殖具有明显的抑制作用,N/P比100时,转染72 h后,细胞存活率下降到(60.45±2.24)%,与阴性对照(86.43±0.87)%有显著差异。细胞凋亡实验结果显示Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞的凋亡有明显促进作用。结论本研究所制备的siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物具有较小的粒径,表面带正电荷,形态为圆形或类圆形。核酸酶和血清蛋白环境中具有良好的siRNA稳定性,细胞毒性小,具有较高的细胞摄取率,较强的靶基因沉默和蛋白下调效率。
【关键词】：基因载体 DMAPA-CHEMS 阳离子脂质体 基因转染 基因沉默
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 缩略词11-14
• 第一章 绪论14-18
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 立题依据16-18
• 第二章 DMAPA-CHEMS脂质体构建和性质考察18-27
• 2.1 仪器和材料18-19
• 2.1.1 主要仪器18
• 2.1.2 主要材料18-19
• 2.2 方法与操作19-21
• 2.2.1 DMAPA-CHEMS的制备19-20
• 2.2.2 DMAPA-CHEMS阳离子脂质体的制备20
• 2.2.3 脂质体形态表征20-21
• 2.2.4 粒径和Zeta电位测定21
• 2.2.5 RNase稳定性和血清稳定性试验21
• 2.3 结果和讨论21-26
• 2.3.1 粒径、Zeta电位和形态测定21-24
• 2.3.2 RNase稳定性和FBS稳定性试验24-26
• 2.4 本章小结26-27
• 第三章 SKOV3细胞对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的摄取及体外评价27-56
• 3.1 仪器与材料27-29
• 3.1.1 主要仪器27-28
• 3.1.2 主要材料28-29
• 3.1.3 细胞株29
• 3.2 溶液的配制29-30
• 3.3 方法和操作30-42
• 3.3.1 细胞的传代培养30-32
• 3.3.2 细胞的转染32-33
• 3.3.3 细胞摄取实验33-34
• 3.3.4 荧光实时定量PCR检测Notchl mRNA的表达34-37
• 3.3.5 Western Blot检测Notchl蛋白表达37-39
• 3.3.6 细胞毒性和增殖实验39-40
• 3.3.7 细胞凋亡实验40-42
• 3.4 实验结果和讨论42-55
• 3.4.1 实验细胞和Notchl siRNA序列的筛选42-44
• 3.4.2 细胞摄取实验44-47
• 3.4.3 Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对Notchl-mRNA表达的影47-48
• 3.4.4 Western Blot检测Notchl蛋白表达48-49
• 3.4.5 细胞毒性实验和增殖实验49-53
• 3.4.6 细胞凋亡实验53-55
• 3.5 本章小结55-56
• 全文总结56-57
• 参考文献57-59
• 文献综述59-74
• 参考文献67-74
• 个人简历74
• 攻读学位期间发表文章情况74

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 陈海靓,陈智,梁文权;反义寡核苷酸脂质体复合物性质对细胞摄入行为的影响[J];药学学报;2002年09期

2 刘翠香,邓英杰;脂质体复合物与肿瘤的基因治疗[J];沈阳药科大学学报;2002年03期

3 余川江;肖雯婧;张冬梅;欧文婧;冯志华;朱文;;FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物特性研究[J];生物医学工程学杂志;2010年04期

4 于丹丹;王春婷;石华山;;Survivin T34A质粒/脂质体复合物抑制Lewis肺癌实验研究[J];中华临床医师杂志(电子版);2011年10期

5 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 陈琰;孙霁;钟延强;;阴-阳离子脂质体复合物介导的基因转染[A];2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集[C];2011年

2 李培才;刘小花;汪尔康;;循环伏安法和光谱法检测阴离子磷脂诱导DNA从脂质体复合物中的释放[A];中国化学会第二十五届学术年会论文摘要集（下册）[C];2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张丽;siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞Notch1基因沉默作用的研究[D];浙江大学;2016年

，

本文编号：1017189