重组人HMGB1蛋白主动免疫对小鼠乳腺癌影响的初步评估

发布时间：2017-10-13 01:33

  本文关键词：重组人HMGB1蛋白主动免疫对小鼠乳腺癌影响的初步评估

  更多相关文章： 高迁移率族蛋白B1 乳腺癌 主动免疫 间接ELISA

【摘要】：背景：高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)是一种普遍存在于真核细胞内的高度保守的非组蛋白染色质结合蛋白,参与DNA修复、重组、复制及转录等多种生命活动。研究发现,在肿瘤发生发展过程中,被释放到细胞外的HMGB1明显增多。胞外HMGB1通过与靶细胞上的受体TLRs或RAGE结合,激活一系列信号通路,促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移,而HMGB1拮抗剂能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖。我们据此推测,以HMGB1蛋白制备的疫苗进行主动免疫可能会影响宿主肿瘤细胞的增殖与转移。本研究利用在原核系统表达、纯化的重组人HMGB1蛋白作为免疫源并给予小鼠进行主动免疫,继而对免疫成功的小鼠乳腺癌移植瘤的生长情况做初步的评估。方法：首先,将本课题组成功构建的含有人HMGB1基因的pET28a-HMGB1导入大肠杆菌BL21内,以乳糖(1g/L)诱导HMGB1蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting进行检测和鉴定。进一步通过镍柱亲和层析系统分离纯化重组的HMGB1蛋白。将纯化的重组HMGB1蛋白与弗氏佐剂混合制备成疫苗,对BALB/c小鼠背部皮下多点注射进行免疫,对照组小鼠给予等量PBS注射。用间接ELISA法检测小鼠血清中抗HMGB1抗体效价。待抗体效价稳定后,将4T1乳腺癌细胞接种于小鼠右腋皮下建立移植瘤模型。成瘤后,每隔两天用游标卡尺测量肿瘤组织的最长径和最短径计算相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率；采用双抗体夹心ELISA测定不同时间点小鼠血清中HMGB1表达水平。根据HMGB1免疫组小鼠和对照组小鼠的相对肿瘤体积、实体瘤重量、组织学观察、抑瘤率等指标来初步评估HMGB1主动免疫对乳腺癌移植瘤生长的影响。结果：SDS-PAGE及Western Blotting结果表明成功得到重组人HMGB1蛋白。以HMGB蛋白作为免疫源免疫雌性BALB/c小鼠后,小鼠血清中抗HMGB1抗体呈阳性,且随着免疫次数的增加,抗体滴度逐渐升高,经过6次免疫后,小鼠体内抗HMGB1抗体效价逐渐趋于稳定,对照组小鼠血清中抗HMGB1抗体为阴性。接种4T1乳腺癌细胞株后第六天,在HMGB1免疫组及对照组小鼠的接种部位可触及不同程度大小的皮下瘤结节,成瘤率100%。随着接种时间的延长,两组小鼠荷瘤体积逐渐地增大,HMGB1免疫组小鼠肿瘤生长速度快于对照组,实体瘤重量也高于对照组(2.337±0.3122g vs 1.997±0.2401g),抑瘤率为-17%。双抗体夹心ELISA结果显示,HMGB1免疫组小鼠荷瘤后,其血清中HMGB1表达水平明显低于对照组。结论：以重组人HMGB1蛋白作为免疫源能够有效地触发BALB/c小鼠产生特异性体液免疫反应。HMGB1主动免疫可显著降低荷瘤小鼠血清中HMGB1表达水平,但不能有效抑制4T1乳腺癌移植瘤的生长。我们的结果提示,通过主动免疫阻断]HMGB1可能难以抑制恶性肿瘤的生长,HMGB1与肿瘤的关系需要进一步探讨。
【关键词】：高迁移率族蛋白B1 乳腺癌 主动免疫 间接ELISA
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 绪论9-26
• 1.1 乳腺癌概述9-12
• 1.1.1 乳腺癌的研究进展9-10
• 1.1.2 乳腺癌动物模型10-12
• 1.2 HMGB1的国内外研究进展12-23
• 1.2.1 HMGB1的分子结构12-13
• 1.2.2 HMGB1的释放13-16
• 1.2.3 HMGB1的作用受体16-17
• 1.2.4 HMGB1的生物学作用17-21
• 1.2.5 HMGB1与靶向治疗21-23
• 1.3 酶联免疫吸附试验23-26
• 第二章 重组人HMGB1蛋白主动免疫对小鼠乳腺癌移植瘤生长的影响26-47
• 2.1 实验材料26-27
• 2.1.1 实验动物26
• 2.1.2 实验试剂26-27
• 2.2 实验方法27-36
• 2.2.1 重组人HMGB1蛋白的原核表达及纯化27-30
• 2.2.2 重组人HMGB1蛋白主动免疫BALB/c小鼠及免疫效价测定30-31
• 2.2.3 皮下瘤模型评估HMGB1主动免疫对乳腺癌移植瘤生长的影响31-36
• 2.3 统计学方法36-37
• 2.4 实验结果37-47
• 2.4.1 重组人HMGB1蛋白的原核表达37
• 2.4.2 重组人HMGB1蛋白的分离纯化37-38
• 2.4.3 HMGB1蛋白主动免疫BALB/c小鼠安全性初步评估38-40
• 2.4.4 BALB/c小鼠抗HMGB1血清效价检测40-41
• 2.4.5 重组人HMGB1蛋白主动免疫降低了荷瘤小鼠血清中HMGB1表达水平41-42
• 2.4.6 重组人HMGB1蛋白主动免疫对4T1乳腺癌移植瘤生长的影响42-44
• 2.4.7 脾脏指数44-45
• 2.4.8 荷瘤小鼠的肿瘤组织的病理学观察45-46
• 2.4.9 结论46-47
• 第三章 讨论与展望47-49
• 3.1 讨论47-48
• 3.2 展望48-49
• 附录49-56
• (一) 英文缩写词一览表49-51
• (二) 主要仪器设备51-52
• (三) 实验主要溶液配制52-56
• 参考文献56-63
• 在读期间发表的学术论文及研究成果63-64
• 致谢64

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本文编号：1022108