ClC-3上调P-gp促进肿瘤耐药的研究

发布时间：2017-10-15 10:42

  本文关键词：ClC-3上调P-gp促进肿瘤耐药的研究

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【摘要】：目的:研究Cl C-3(voltage-gated chloride channel 3)氯通道蛋白在肿瘤耐药中的作用,确定其是通过调控P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)来介导肿瘤细胞耐药,为Cl C-3蛋白功能的研究开辟新的方向以及基于逆转肿瘤耐药的肿瘤治疗提供理论依据。方法:①Western blot检测人肺腺癌细胞株A549及其紫杉醇耐药株A549/T和人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药株MCF-7/ADR中Cl C-3蛋白和P-gp的表达。②A549/T和MCF-7/ADR细胞转染Cl C-3小干扰RNA(Si-Cl C-3)抑制Cl C-3的表达,A549和MCF-7细胞转染Cl C-3表达质粒(pc DNA3.1/Cl C-3)增强Cl C-3的表达,MTT法检测抗癌药物紫杉醇对Cl C-3表达干预后细胞增殖的影响。③A549/T和MCF-7/ADR细胞转染Si-Cl C-3,A549和MCF-7细胞转染pc DNA3.1/Cl C-3,细胞免疫荧光结合激光共聚焦技术和Western blot检测Cl C-3蛋白和P-gp的表达水平。④A549/T和MCF-7/ADR细胞转染多药耐药基因(multi-drug resistance gene 1,MDR1)小干扰RNA(Si-MDR1)抑制P-gp的表达,A549和MCF-7细胞转染MDR1表达质粒(pc DNA3.1/MDR1)增强P-gp的表达,细胞免疫荧光和Western blot检测P-gp和Cl C-3蛋白的表达水平。⑤繁育MMTV-Py MT单转基因小鼠,建立和繁育Cl C-3过表达的自发乳腺肿瘤MMTV-Py MT/CLCN3双转基因小鼠,给予紫杉醇和阿霉素化疗干预;紫杉醇化疗方案分为M-N1(单转基因小鼠给予生理盐水)、M-PTX(单转基因小鼠给予紫杉醇)、MC-N1(双转基因小鼠给予生理盐水)和MC-PTX(双转基因小鼠给予紫杉醇)共4组;阿霉素化疗方案分为M-N2(单转基因小鼠给予生理盐水)、M-ADM(单转基因小鼠给予阿霉素)、MC-N2(双转基因小鼠给予生理盐水)和MC-ADM(双转基因小鼠给予阿霉素)共4组;测量小鼠体重、肿瘤重量、肿瘤体积和小鼠生存期。⑥实时荧光定量PCR法检测肿瘤组织中MDR1和Cl C-3 m RNA的表达;Western blot和免疫组化法检测肿瘤组织中P-gp及Cl C-3蛋白的表达。结果:①MCF-7/ADR与MCF-7相比,A549/T与A549相比,耐药细胞株Cl C-3和Pgp的表达量明显高于非耐药细胞株。②下调A549/T和MCF-7/ADR细胞Cl C-3的表达,紫杉醇对细胞增殖的抑制作用明显增强;增强A549和MCF-7细胞Cl C-3的表达,紫杉醇对细胞增殖的抑制作用明显减弱。③抑制A549/T和MCF-7/ADR细胞Cl C-3的表达引起P-gp的表达下调;增强A549和MCF-7细胞Cl C-3的表达则上调P-gp的表达。④抑制A549/T和MCF-7/ADR细胞MDR1的表达或增强A549和MCF-7细胞MDR1的表达都对P-gp的表达水平无明显影响。⑤MC-N1和MC-N2组肿瘤体积和重量分别显著高于M-N1组和M-N2组;MC-PTX组与M-PTX组相比,紫杉醇对肿瘤生长的抑制率降低;MC-ADM组与M-ADM组相比,阿霉素对肿瘤生长的抑制率降低;紫杉醇治疗可以提高MMTV-Py MT单转基因小鼠小鼠生存率,而对MMTV-Py MT/CLCN3双转基因小鼠小鼠生存率无影响。⑥与MMTVPy MT单转基因小鼠相比,MMTV-Py MT/CLCN3双转基因小鼠MDR1 m RNA和Pgp表达增加。结论:肿瘤细胞中Cl C-3与P-gp的表达水平呈正相关,Cl C-3在肿瘤细胞耐药中起着重要的作用,其介导肿瘤细胞耐药与上调P-gp的表达有关
【关键词】：ClC-3 P-gp 多药耐药 转基因小鼠 肿瘤
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-16
• 第一部分ClC-3 参与肿瘤耐药16-38
• 1 材料16-18
• 1.1 细胞株、质粒及主要试剂16-17
• 1.2 Si-ClC-3 序列17
• 1.3 实验动物17-18
• 1.4 主要设备18
• 2 方法18-25
• 2.1 细胞培养18-19
• 2.2 Western blot检测细胞中ClC-3 蛋白及P-gp的表达19-21
• 2.3 体外转染Si-ClC-321
• 2.4 体外转染pc DNA3.1/ClC-3 表达质粒21
• 2.5 MTT法检测抗癌药物紫杉醇对细胞增殖的影响21-23
• 2.6 双转基因乳腺癌小鼠模型的建立23-24
• 2.7 转基因小鼠分组和给药方案24-25
• 2.8 数据统计与处理25
• 3 实验结果25-34
• 3.1 ClC-3 蛋白和P-gp在耐药细胞株中的表达高于非耐药细胞25-26
• 3.2 耐药细胞ClC-3 表达抑制可增加细胞对抗癌药物的敏感性、非耐药细胞ClC-3表达增加可降低细胞对抗癌药物的敏感性26-27
• 3.3 各组小鼠及瘤体的生长情况27-33
• 3.3.1 各组小鼠体重、肿瘤生长情况及不同时间点的抑瘤率28-31
• 3.3.2 各组小鼠瘤重、瘤体积、抑瘤率差异31-33
• 3.4 各组小鼠生存期差异33-34
• 4 讨论34-38
• 5 小结38
• 第二部分ClC-3 通过调控P-gp介导肿瘤耐药38-62
• 1 材料39-40
• 1.1 荧光定量PCR引物序列及主要试剂39
• 1.2 Si-ClC-3、Si-MDR1序列39-40
• 1.3 实验动物40
• 2 方法40-46
• 2.1 体外转染Si-ClC-3、Si-MDR140
• 2.2 体外转染pc DNA3.1/ClC-3 表达质粒、pc DNA3.1/MDR1表达质粒40
• 2.3 免疫荧光检测细胞中ClC-3 蛋白及P-gp的表达40-41
• 2.4 Western blot检测细胞中ClC-3 蛋白及P-gp的表达41-42
• 2.5 Real-Time PCR检测肿瘤组织中ClC-3 及MDR1 m RNA的表达42-44
• 2.6 Western blot检测肿瘤组织中ClC-3 及P-gp蛋白的表达44
• 2.7 瘤体病理组织学观察44
• 2.8 免疫组化检测肿瘤组织ClC-3 蛋白及P-gp的表达44-45
• 2.9 数据统计与处理45-46
• 3 实验结果46-58
• 3.1 耐药细胞中ClC-3 表达抑制可降低P-gp的表达，，MDR1表达抑制对ClC-3 蛋白的表达无影响46-48
• 3.2 非耐药细胞中ClC-3 表达增加可提高P-gp的表达，MDR1表达增加对ClC-3蛋白的表达无影响48-51
• 3.3 耐药细胞ClC-3 表达抑制可降低P-gp的表达，非耐药细胞ClC-3 表达增加可提高P-gp的表达51-52
• 3.4 耐药细胞P-gp表达抑制及非耐药细胞P-gp表达增加对ClC-3 蛋白的表达无影响52-53
• 3.5 MMTV-Py MT/CLCN3双转基因小鼠肿瘤组织中MDR1及ClC-3 m RNA的表达都明显高于MMTV-Py MT单转基因小鼠53-55
• 3.6 MMTV-Py MT/CLCN3双转基因小鼠肿瘤组织中多药耐药蛋白P-gp及ClC-3 蛋白的表达都明显高于MMTV-Py MT单转基因小鼠55-56
• 3.7 瘤组织病理学观察56-57
• 3.8 MMTV-Py MT/CLCN3双转基因小鼠肿瘤组织中P-gp及ClC-3 蛋白的表达都明显高于MMTV-Py MT单转基因小鼠57-58
• 4 讨论58-61
• 5 小结61-62
• 全文结论62
• 展望62-63
• References63-71
• 附录一 硕士期间发表的论文71-72
• 附录二 中英文缩写词对照表72-73
• 致谢73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王泽新;汪森明;周琪;胡喜钢;朱伟良;孟辉;张积仁;;内皮抑素不同给药途径联合阿霉素治疗鼠肝移植瘤[J];南方医科大学学报;2010年08期

2 张化莲;张梅月;周爱青;;紫杉醇对宫颈癌HeLa细胞增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤生长抑制作用[J];肿瘤基础与临床;2006年04期

3 韩颖;周芳;蔡政;李醒亚;;紫杉醇节律化疗抗Lewis肺癌血管生成作用的实验研究[J];肿瘤基础与临床;2007年04期

本文编号：1036681