吴茱萸碱通过SIRT1影响人结肠癌细胞增殖和迁移的实验研究

发布时间：2017-10-16 13:04

  本文关键词：吴茱萸碱通过SIRT1影响人结肠癌细胞增殖和迁移的实验研究

  更多相关文章： 吴茱萸碱 HCT-116 HT-29细胞 增殖 迁移

【摘要】：结肠癌作为一种常见的胃肠道恶性肿瘤,其发病率居全球常见恶性肿瘤的第三位。目前临床上治疗结肠癌的首选方法为手术切除并辅以化疗,尽管化疗对癌细胞有直接的杀灭作用,但也会对正常细胞造成一定的损伤且易于复发,部分病人因承受不了化疗的痛苦而放弃治疗甚至因化疗致死。因而寻找一种新型低毒高效的抗结肠癌药物迫在眉睫。吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)是从吴茱萸干燥果实中提取的生物碱,近年来的研究表明其对多种肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤药物活性,但目前对人结肠癌细胞的作用及相关机制的报道较少。沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)是sirtuin家族中的组蛋白脱乙酰酶,它是酵母沉默信号调节因2(silencing information regulator 2,sir2)在人体中的类似物。SIRT1能够依赖NAD+使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化,隶属于第III类去乙酰化酶即Sirtuin家族。SIRT1主要通过组蛋白H1上赖氨酸残基k26脱乙酰化、组蛋白H3上赖氨酸残基k9脱乙酰化、组蛋白H4上赖氨酸残基k16脱乙酰化作用来修饰组蛋白。有研究报道,SIRT1在前列腺癌、原发性结肠癌、急性髓性白血病中均明显过表达。此外,SIRT1在鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌中也高表达。王澈等研究发现吴茱萸碱可以抑制人黑色素瘤A375 S2细胞SIRT1的表达。NF-кB(nuclear factor-kappa B)是一种细胞核转录因子,近几年大量的研究表明,NF-кB与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡、侵袭和转移密切关系,因此备受广大学者的关注。研究发现SIRT1能够在NAD+的辅助下对NF-кB亚基脱乙酰化,脱乙酰化的NF-кB无法与IкBα结合,其核定位信号无法暴露,难以进入细胞核内与特定基因的启动子区域(5-'GGGACTTTCC-3')结合,启动促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移等的特定基因的转录。MMPs家族蛋白参与肿瘤的迁移过程。Wen等报道,SIRT1可诱导MMPs家族中MMP-9基因的转录和翻译。另外也有报道称,磷酸化的NF-кB可以直接与MMP-9启动子结合从而调节核内MMP-9的合成。既然SIRT1和NF-кB都与MMP-9有着密切关系,且MMP-9作为SIRT1和NF-кB共同的下游蛋白存在,因此,我们提出假设:SIRT1在NF-кB和MMP-9所致的肿瘤迁移中起到至关重要的作用。方法体外培养人结肠癌HCT-116和HT-29细胞株,分别加入Evo 1.5、3、6、12、24、48、96μmol·L-1继续培养48 h,CCK-8法检测Evo对HCT-116和HT-29细胞生存活性的影响;Transwell法和划痕法检测Nampt(SIRT1)Evo对HCT-116和HT-29细胞体外迁移的影响;RT-PCR和Western Blot检测不同浓度的Evo(1.5、3、6μmol·L-1)和Nampt(10μg·L-1)诱导HCT-116和HT-29细胞48h后,细胞中SIRT1、NF-кB、MMP-9蛋白的表达情况。将HCT-116细胞接种到4周龄的Balb/c裸小鼠右下腹部,荷瘤直径生长到约0.5cm后,Evo(3mg/Kg)灌胃治疗(每天一次),并监测瘤体直径及小鼠体重,治疗22天后收集标本,计数结肠转移瘤个数;HE染色观察荷瘤细胞的形态改变,免疫组化和Western Blot检测SIRT1、NF-кB/P65、MMP-9蛋白的表达变化。结果1.不同浓度的Evo(1.5、3、6、12、24、48、96μmol·L-1)作用于HCT-116和HT-29细胞48h后,两种细胞的增殖均受到明显抑制(P0.05),且在一定范围内呈浓度依赖性;且Evo能抑制HCT-116和HT-29细胞的迁移。2.Evo可明显下调HCT-116和HT-29细胞内SIRT1、MMP-9 m RNA和蛋白的表达,上调NF-кB m RNA和蛋白的表达。3.Evo组的荷瘤重(0.63±0.13)g,明显低于模型组(3.00±0.57)g,差异有统计学意义(P0.01);Evo组的瘤体积(941.98±122.59)mm3显著小于模型组(1563.48±240.90)mm3(P0.01);Evo组小鼠的体重(25.60±0.63)g明显大于模型组(15.54±0.50)g,且有统计差异(P0.01)。HE染色结果显示:在荷瘤小鼠体内,Evo能显著加快荷瘤细胞中核的固缩,促进细胞凋亡。4.在体内实验,与模型组相比,Evo组小鼠瘤体组织中NF-кB表达增强,而SIRT1、MMP9表达降低。结论体内外实验表明,Evo对结肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用是通过抑制SIRT1的表达,激活NF-кB信号通路,进而抑制MMP-9来实现的。
【关键词】：吴茱萸碱 HCT-116 HT-29细胞 增殖 迁移
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-16
• 第一部分 吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116 和HT-29 细胞体外增殖和转移的影响及其作用机制的研究16-29
• 1 材料16-22
• 2 结果22-26
• 3 图片26-29
• 第二部分 吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116 细胞体内迁移的影响及其作用机制的研究29-39
• 1 材料和方法29-32
• 2 结果32-35
• 3 图片35-39
• 讨论39-42
• 全文总结42-43
• 参考文献43-46
• 文献综述：吴茱萸碱抗肿瘤活性的研究进展46-52
• 参考文献49-52
• 致谢52-53
• 攻读硕士学位期间发表的论文53

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本文编号：1042818