重组人β防御素-2抗胃癌BGC823活性研究

发布时间：2017-10-17 03:31

  本文关键词：重组人β防御素-2抗胃癌BGC823活性研究

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【摘要】：人p防御素-2(hBD2),是一种普遍表达在人体上皮组织的内源性抗微生物肽。有着广谱高效的抗微生物作用,具有机体免疫应答、化学趋化及其他蛋白酶的协同作用,但关于人β防御素与肿瘤之间的确切关系仍未见到研究文献报道。胃癌已成为当前威胁人类健康的第二大恶性肿瘤,传统的治疗手段不能很好的解决胃癌转移和复发的问题,寻找安全高效的治疗手段已经成为目前急需要处理的问题。目的：重组真核表达质粒pCMV-hBD2,并瞬时转染于胃癌细胞株(BGC823)与正常人胃粘膜细胞(GES-1)中。检测相对高表达hBD2对胃癌细胞株BGC823的活性影响,并初步探讨其机理。方法：利用分子生物学方法重组pCMV-hBD2真核表达质粒,通过非脂质体转染试剂转染于胃癌细胞株(BGC823)与正常人胃粘膜细胞(GES-1)内。在瞬时表达期间,用荧光实时定量PCR和Western blotting检验hBD2在mRNA和蛋白水平的表达情况。并运用MTS法、克隆存活实验、Transwell迁移和侵袭小室实验,检测其对BGC823细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭功能的影响。同时通过荧光定量PCR和Western blotting检验MMP2在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：重组载体经核酸序列测序后,证实接入目的基因hBD2片段方向正确,基因序列与基因库所报道核苷酸序列相符。检测到转染hBD2细胞组,其hBD2相对表达量显著高于其余组。BGC823细胞转染hBD2组较于其他组,增殖和克隆形成显著性降低,但正常胃粘膜细胞GES-1增殖未受影响。观察到转染hBD2的BGC823细胞组较于其他组,迁移和侵袭的活性被明显抑制。并且发现转染hBD2的BGC823细胞MMP2相对表达量显著下降。结论：成功构建hBD2的真核表达质粒pCMV-hBD2; hBD2显著抑制胃癌BGC823细胞增殖、克隆过程,但不影响正常细胞GES-1增殖；hBD2还有效降低BGC823细胞的迁移和侵袭功能；hBD2的抑制BGC823的这种作用可能是通过抑制MMP2的表达实现的。
【关键词】：人β防御素-2 基因重组 抗瘤活性 胃癌BGC823
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-9
• 第一章 前言9-15
• 第二章 实验材料15-23
• 2.1 质粒、细胞株15
• 2.2 实验试剂及耗材15-16
• 2.3 实验主要仪器设备16-17
• 2.4 引物设计17-18
• 2.5 主要试剂以及配置18-23
• 第三章 实验方法23-41
• 3.1 真核表达质粒pCMV-hBD2重组23-30
• 3.1.1 菌株的扩大培养23-24
• 3.1.2 DNA质粒提取24-25
• 3.1.3 双酶切反应25
• 3.1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳后目的产物回收25-27
• 3.1.5 连接反应27
• 3.1.6 转化27-28
• 3.1.7 重组质粒DNA获取28-29
• 3.1.8 重组质粒pCMV-hBD2检测29-30
• 3.1.9 菌株冻存30
• 3.2 细胞培养30-32
• 3.2.1 细胞培养前准备30
• 3.2.2 细胞复苏30-31
• 3.2.3 细胞传代31
• 3.2.4 细胞冻存31-32
• 3.3 细胞转染32-33
• 3.3.1 细胞准备32
• 3.3.2 转染溶液配置32
• 3.3.3 瞬时转染32-33
• 3.4 荧光实时定量PCR33-35
• 3.4.1 各细胞总RNA提取33
• 3.4.2 RNA浓度测定33
• 3.4.3 RNA逆转录cDNA33-34
• 3.4.4 荧光定量PCR34-35
• 3.5 细胞增殖实验35
• 3.5.1 细胞准备35
• 3.5.2 MTS法检测35
• 3.6 肿瘤细胞克隆形成实验35-36
• 3.6.1 克隆细胞培养35-36
• 3.6.2 结晶紫染色计数36
• 3.7 Transwell迁移及侵袭小室36-37
• 3.7.1 肿瘤细胞饥饿处理36
• 3.7.2 肿瘤侵袭实验预铺胶36
• 3.7.3 肿瘤迁移、侵袭实验36
• 3.7.4 结晶紫染色计数36-37
• 3.8 Western blotting37-40
• 3.8.1 细胞总蛋白提取37
• 3.8.2 BCA法测定蛋白定量37-38
• 3.8.3 制胶38
• 3.8.4 蛋白电泳38
• 3.8.5 电转移38-39
• 3.8.6 免疫印记39
• 3.8.7 Western blotting结果分析39-40
• 3.9 数据统计分析40-41
• 第四章 实验结果41-45
• 4.1 重组真核表达载体pCMV-hBD241
• 4.2 瞬时转染hBD2表达情况41-42
• 4.2.1 mRNA水平检测hBD2表达情况41-42
• 4.2.2 蛋白水平检测hBD2表达情况42
• 4.3 hBD2对细胞增殖及克隆的影响42-43
• 4.3.1 hBD2对细胞增殖的影响42
• 4.3.2 hBD2对细胞克隆的影响42-43
• 4.4 hBD2对细胞迁移及侵袭的影响43-44
• 4.4.1 hBD2对BGC823迁移的影响43
• 4.4.2 hBD2对BGC823侵袭的影响43-44
• 4.5 检测影响对胃腺癌BGC823细胞MMP2表达的影响44-45
• 4.5.1 荧光实时定量PCR检测MMP2表达44
• 4.5.2 Western blotting检测hBD2对MMP2表达情况44-45
• 第五章 讨论45-48
• 第六章 结论48-49
• 第七章 参考文献49-54
• 第八章 图片附录54-66
• 在校期间的研究成果66-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 段纪俊;陈万青;张思维;;中国恶性肿瘤死亡率的国际比较[J];中国社会医学杂志;2009年06期

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本文编号：1046574