二烯丙基二硫化物对人白血病KG1-α细胞增殖及凋亡的影响及其机制的研究

发布时间：2017-10-18 00:29

  本文关键词：二烯丙基二硫化物对人白血病KG1-α细胞增殖及凋亡的影响及其机制的研究

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【摘要】：背景目的白血病是高发的造血系统恶性肿瘤,其治疗以化疗、骨髓移植为主。而由于部分化疗药物的耐药及化疗严重副作用,白血病的预后较差,因此迫切需要寻找新的有效的治疗方法或者药物靶点。二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide, DADS)是大蒜中一种脂溶性有效成分,对前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌等细胞均有抑制作用,。其主要作用机制是通过阻滞细胞周期,促进肿瘤凋亡和分化,增加组蛋白乙酰化水平和抑制肿瘤细胞的转移等。肿瘤细胞具有独特的代谢方式,即在氧气充足的条件下,肿瘤细胞并不依赖线粒体进行氧化磷酸化功能,而是摄取大量葡萄糖,产生乳酸及能量,该过程叫有氧糖酵解。丙酮酸激酶MII(pyruvate kinase isoenzyme typeM2, PKM2)是该过程的关键酶,它催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)产生丙酮酸。Christofk等的研究发现PKM2表达增加可导致肿瘤细胞的有氧糖酵解异常代谢,采用shRNA敲除人肺癌细胞株H1299中PKM2基因并以PKM1替代,可使、Varburg效应逆转,同时将这种处理过的H1299细胞株接种裸鼠,发现其致瘤性明显降低,从而证实PKM2在肿瘤细胞生长中的重要作用。通常情况下PKM2以二聚体和四聚体的形式存在,其不同的形式表现出不同的酶活性,其中只有二聚体形式的PKM2能入核参与基因转录,从而促进肿瘤的发生。Yang[25,26]等报道了PKM2入核与激活表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)有关。那么,DADS对白血病细胞的增殖是否有影响?其对肿瘤细胞的增殖抑制是否与PKM2有关?DADS能否影响PKM2的表达或入核?目前尚未见到相关报道。方法第一部分通过蛋白质印迹法检测人白血病HL-60、K562、KG1-α细胞株以及正常人单个核细胞中PKM2蛋白表达量。运用CCK-8法检测DADS对人白血病KG1-α细胞增殖的影响。采用FCM检测DADS对人白血病KG1-a细胞周期和凋亡的影响。lochest染色观察细胞的凋亡形态学改变。应用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测DADS对人白血病KG1-a细胞的CCND1、c-Myc的mlNA表达量的影响。应用蛋白质免疫印迹法检测DADS对KG1-α细胞中Bax、Bcl-2、 Cleaved-caspase 3、CyclinD1、P21蛋白表达的影响；分别提取核蛋白、浆蛋白。采用蛋白免疫印迹法和免疫荧光检测DADS对细胞核核细胞浆中PKM2表达的影响。运用免疫荧光检测DADS处理后PKM2在KG1-α细胞内的表达和分布的变化。第二部分为更进一步阐明DADS对PKM2影响的机制,采用蛋白免疫印迹法检测DADS对P-EGFR、P-ERK、P-MEK1/2、EGFR、ERK、MEK、PIN1、p-catenin表达的影响。以及单独使用EGFR抑制剂AG-1478或联合DADS诱导对PKM2入核通路的影响。实验结果1、Western Blot筛选结果,人白血病细胞株KG1-α中PKM2蛋白表达最高。2、CCK-8结果显示DADS对人白血病细胞株KG1-α的增殖抑制作用明显。3、FCM检测细胞周期：DADS诱导KG1-α后使得细胞周期阻滞G0/G1期,G2/M期、S期所占比例减少。G0/G1期比例：空白对照组(41.19±0.05)%,50μmol/L处理组为(54.32±0.02)%,10μmol/L处理组为(68.70±0.02)%。(P0.05)4、FCM检测细胞凋亡：空白对照组凋亡率(1.98±0.23)%,50 μmol/ L处理组(17.75±0.80)%,100μmol/L处理组为(23.01±1.27)%。(P0.05)5、Hochest染色结果显示,经DADS诱导后,KG1-α细胞产生了典型凋亡形态学改变。6、RT-PCR结果显示,DADS下调CCND1、c-Myc的nRNA的表达水平。7、Western Blot结果,DADS可减少细胞核中PKM2的积聚,对细胞质中PKM2的表达则无明显影响。DADS上调Bax. P21、 Cleaved Caspase-3的表达,下调Bc1-2、CyclinD1的表达。8、免疫荧光结果显示：经DADS诱导8h后,药物组细胞在细胞核内的PKM2表达明显下降。9、Western Blot结果,DADS可下调P-EGFR、P-ERK、P-MEK1/2。应用EGFR抑制剂AG-1478抑制EGFR磷酸化,阻断EGFR/ERK/PKM2信号通路后,细胞核中PKM2的含量减低；联合应用DADS, PKM2水平比单用AG-1478或DADS降低更明显。P-EGFR、P-ERK、P-MEK1/2蛋白表达水平亦如此。结论1、在人白血病细胞中KG1-α细胞中PKM2蛋白表达最高,DADS对KG1-α细胞有明显增殖抑制的作用,通过将阻滞在G0/G1期,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡。2、DADS通过上调Bax、P21、Cleaved Caspase-3的表达,下调Bcl-2、CyclinD1的表达,使细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制KG1-α细胞的增殖,并促进其凋亡。3、DADS可减少核内PKM2的积聚,通过EGFR/ERK/PKM2信号通路抑制细胞增殖及促进凋亡。
【关键词】：二烯丙基二硫 白血病细胞 细胞凋亡 细胞增殖 PKM2
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-17
• 前言17-19
• 第一部分 二烯丙基二硫对人白血病细胞增殖、凋亡的影响19-44
• 前言19
• 1 材料和方法19-30
• 2 结果30-36
• 3 讨论36-40
• 第一部分图片40-44
• 第二部分 二烯丙基二硫对白血病细胞KG1-α EGFR/ERK/PKM2信号通路的影响44-56
• 前言44
• 1 材料和方法44-47
• 2 结果47-51
• 3 讨论51-54
• 第二部分图片54-56
• 全文总结56-57
• 参考文献57-61
• 文献综述：二烯丙基二硫抗肿瘤机制61-69
• 参考文献65-69
• 致谢69-70
• 硕士期间发表的论文70

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本文编号：1051918