乳腺癌血清microRNA表达谱差异分析及其功能验证

发布时间：2017-10-20 05:08

  本文关键词：乳腺癌血清microRNA表达谱差异分析及其功能验证

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【摘要】：目的：以临床确诊的乳腺癌患者和正常体检人员为对象,研究两者血清中miRNAs的表达谱差异,通过筛选验证,获得乳腺癌血清特异性目的miRNAs,加快血清miRNA作为biomarker向临床转化的应用进程,为乳腺癌的诊断治疗提供了新的潜在生物学标志物,同时对miRNA在乳腺癌中的功能进行初步研究,为miRNA乳腺癌发生发展中作用机制研究奠定基础。方法：选取10例确诊的乳腺癌病人和10例正常人样本,利用高通量测序对10对乳腺癌病理组织、旁组织、血清和正常人血清进行miRNA测序,并利用TargetScan、 Clip-seq等数据库筛选出在乳腺癌中特异表达的miRNAs;利用实时荧光定量RT-PCR对筛选结果进行大样本血清验证,利用SPSS统计分析,筛选出差异性表达的目的miRNAs,设计合成miRNA抑制剂,转染至乳腺癌细胞MB-435、MB-468,利用CCK8检测乳腺癌细胞株转染miRNA inhibitor后的活力,利用TargetScan miRanda预测具有功能表达的miRNA靶基因,为功能研究奠定基础。结果：1.分析乳腺癌病理组织、旁组织和正常人血清的miRNA高通量测序测序结果,通过对不同样本的Clean data的比较,分析其共有Reads以及特有的Reads,以log2(Fold Change)=1、P-value0.01为差异表达的筛选标准,在986条差异表达中筛选出28个差异性表达的miRNAs,包括hsa-miR-144-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-let-7i-5p、 hsa-miR-323-5p、hsa-miR-110a-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-326-5p、 hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-195a-5p、 hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-374-5p、hsa-miR-26a、 hsa-miR-23-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-143、hsa-miR-30a、hsa-miR-126、 hsa-miR-125b、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-99a、hsa-miR-451a、 hsa-miR-320a、hsa-miR-223-3p。2.以差异表达量大于2倍以上,RT-PCR中CT值小于30作为标准,共筛选出4条特异目的miRNAs,即hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-320a进行血清学表达验证分析。3.在113例乳腺癌患者以及104例健康对照组血清中对目标miRNAs表达进行定量分析,结果表明miRNAs在血清中稳定表达,乳腺癌组与对照组相比,hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p及hsa-miR-320a相对表达量上调,乳腺癌患者血清中4个目标miRNAs的表达情况与前期乳腺癌组织中的表达情况一致,差异均有统计学意义(P0.05),目的miRNAs的表达与临床病理特征存在一定相关性。4.我们选取测序结果中和验证的目的miRNAs,利用CCK8检测转染后的细胞活力情况,结果发现,miR-223-3p inhibitor在MDA-MB-468中抑制miR-223-3p的表达,从而抑制MDA-MB-468的活力；同时,miR-423-5p inhibitor在MDA-MB-468和MDA-MB-453中同时抑制这两种细胞活力表达,提示miR-223-3p、miR-423-5p对乳腺癌细胞活性存在调控作用,具有抑制抑癌基因的功能；另利用TargetScan、miRanda两个数据库对miR-223-3p、miR-423-5p的靶基因进行预测,为下一步乳腺癌特异miRNA的功能研究奠定基础。结论：本课题选取乳腺癌组织、癌旁组织以及乳腺癌血清和正常人血清为研究对象,利用新一代高通量测序筛选出差异表达的miRNAs,初步建立了乳腺癌特异性的miRNAs差异表达谱。在对测序结果中表达上调的miR-374a-5p、miR-223-3p、miR-423-5p、 miR-320a血清学验证发现,其在血清和组织中的表达趋势一致,并与临床病理存在着关联,有可能作为乳腺癌诊断的潜在标志物；在利用CCK-8检测4个上调的miRNAs的功能中发现,miR-223-3p、miR-423-5p在乳腺癌细胞中具有功能表达,可能发挥着抑制抑癌基因的作用,影响着乳腺癌的发生发展进程,为miRNA在乳腺癌中的功能研究提供线索。
【关键词】：乳腺癌 表达谱分析 差异表达 功能分析
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 引言10-14
• 1.1 乳腺癌的现状10-11
• 1.1.1 乳腺癌发展现状10
• 1.1.2 乳腺癌诊断现状及存在问题10-11
• 1.1.3 乳腺癌研究新进展11
• 1.2 microRNA11-13
• 1.2.1 miRNA的生物合成12
• 1.2.2 miRNA与肿瘤12-13
• 1.2.3 miRNA在乳腺癌中的研究进展13
• 1.2.4 miRNA标志物在乳腺癌辅助诊断中的应用13
• 1.3 MIRNA研究思路及新机遇13-14
• 第一部分 miRNA高通量测序及表达差异筛选14-24
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 主要仪器14-15
• 1.1.2 主要试剂15
• 1.1.3 主要试剂制备15
• 1.2 研究对象与方法15-18
• 1.2.1 研究对象15-16
• 1.2.2 标本处理16
• 1.2.3 RNA提取16-17
• 1.2.4 高通量测序17-18
• 1.3 实验结果分析18-22
• 1.3.1 RNA质量检测电泳结果18
• 1.3.2 测序结果分析18-20
• 1.3.3 结果20-22
• 1.4 讨论22-24
• 第二部分 乳腺癌差异性miRNA血清学验证24-32
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 主要仪器24-25
• 2.1.2 主要试剂25
• 2.1.3 引物设计25
• 2.2 实验对象及标本处理25-26
• 2.2.1 实验对象25-26
• 2.2.2 标本处理26
• 2.3 实验方法26-28
• 2.3.1 血清miRNA提取26-27
• 2.3.2 miRNA cDNA第一链合成27-28
• 2.3.3 miRNA荧光定量PCR28
• 2.3.4 数据处理与统计28
• 2.4 结果28-31
• 2.4.1 血清循环miRNA的RT-PGR检测28-30
• 2.4.2 实验组和对照组血清中miRNA表达情况分析30-31
• 2.5 讨论31-32
• 第三部分 miR-223、miR-423-5P在乳腺癌中功能的初步研究32-38
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 主要仪器32
• 3.1.2 主要试剂32-33
• 3.2 实验方法33-34
• 3.2.1 乳腺癌细胞的培养33
• 3.2.2 MDA-MB-453、MDA-MB-468细胞转染33-34
• 3.2.3 miRNA-223-3p inhibitor、miR-423-5p inhibitor转染后的检测34
• 3.2.4 miR-223靶基因预测及功能分析34
• 3.3 实验结果34-36
• 3.3.1 MDA-MB-453、MDA-MB-468细胞培养34
• 3.3.2 CCK8检测miRNA对乳腺癌细胞生长活力的影响34-35
• 3.3.3 miR-223-3p、miR-423-5p靶基因预测及分类35-36
• 3.4 讨论36-38
• 结语38-39
• 参考文献39-41
• 附录41-48
• 附录1：英文缩写词41-42
• 附录2：综述42-48
• 参考文献46-48
• 在校期间发表论文情况48-49
• 致谢49-50
• 统计学审核证明50

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