高通量测序技术在骨髓增殖性肿瘤临床检测中的方法学建立及其初步应用

发布时间：2017-10-21 00:14

  本文关键词：高通量测序技术在骨髓增殖性肿瘤临床检测中的方法学建立及其初步应用

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【摘要】：研究背景与目的：骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN)是一组起源于造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病,以外周血一系或多系细胞增多,易发生血栓和出血等并发症,自发性向急性白血病和骨髓纤维化转化为共同临床特点的一类髓系增殖性疾病。1960年在慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)中发现Ph染色体；然而在随后的半个多世纪里,对于Ph阴性的MPN遗传学背景知之甚少。2005年获得性点突变JAK2V617F的发现,使MPN的研究迅速进入基因组时代。在随后的10年,MPL (TPO受体)突变、JAK2第12外显子的突变及编码钙网蛋白(CALR)的基因第9号外显子突变相继发现并被报道。JAK2V617F、MPL、JAK2第12外显子以及CALR基因突变的发现,使更多MPN患者找到了有力的诊断依据。目前,越来越多文献报道两种或多种基因突变同时存在的MPN病例,不同表型的MPN可以发生相互转化甚至进展为急性髓系白血病,单一的分子突变已无法解释此类MPN患者临床表现型的多样化。检测多个分子以及综合考虑各种分子学突变,才能更进一步了解MPN的发病机制、准确评估患者的预后以及实现对MPN患者的个体化治疗。快速、准确和全面地获取MPN患者的DNA分子遗传信息对于临床研究以及指导临床治疗具有十分重要的意义。对于每个生物体来说,其基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映患者基因组DNA上的遗传信息,进而比较全面地揭示患者基因组DNA的复杂性和多样性。1977年Sanger发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert发明的化学降解法,标志着第一代测序技术的诞生。Sanger测序迄今为止仍是DNA测序的主流方法,但是测序速度慢、成本高、通量小使得传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要。新一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量测序技术。新一代测序技术具有速度快、准确度高、成本低、覆盖度深和产出巨大等优点,研究者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位和分析,在临床检测中有广泛的应用前景。Ion TorrentPGM测序仪是一种基于半导体芯片的新一代测序技术,通过专有的大规模并行半导体感应器,对于DNA复制时产生的离子流,实现直接和实时的检测。IonTorrent技术具有准确度高、速度快、灵活性大等优点。目前已应用于多领域的研究,如癌症、遗传疾病、妇婴健康领域、血液相关疾病、微生物研究和生物学基础研究等。Thermo Life公司推出的AmpliSeq建库方案,该技术仅利用20ng样品就可在一管中同时扩增6144种PCR片段,使科研人员能快速的分析成千上万个目标基因。目前Thermo Life已推出了商业化Cancer Hotspot Panel,其中大多基因涉及的是实体肿瘤,其对血液系统疾病的研究还较少。Ion Torrent PGM测序平台的可扩展性允许研究人员可以自由的选择感兴趣的几十甚至几百个基因定制多重PCR引物试剂盒。通过查阅大量文献,我们定制了MPN致病相关基因的多重PCR引物试剂盒,包括JAK2、MPL、CALR、KIT、ASXL1、IDH1、 IDH2、LNK、CBL、TET2、EZH2、DNMT3A、U2AF1、SRSF2、SF3B1、CSF3R、 TP53、SOCS1、SOCS2、SOCS3、NRAS、KRAS及NEF共23种基因。本课题第一部分的目的是在于研究Ion Torrent PGM测序平台及定制的MPN多重引物试剂盒在骨髓增殖性肿瘤临床诊断中的方法学建立。结合近年来的研究,约95%-98%的PV (Polycythemia vera)、约50%-60%的ET (Essential thrombocythemia)及PMF (Primary myelofibrosis)患者存在JAK2突变,约4%的ET患者及8%的PMF患者存在MPL突变,CALR突变在PV患者中罕见,在ET患者中的突变率约为15%-24%,在PMF患者中的突变率约为25%-35%左右。然而,仍有15%的MPN病人不存在以上三种突变,此类MPN归类于三阴性MPN。目前对于三阴性的MPN,因为缺乏三种主要的分子学突变,造成其诊断困难。本课题第二部分的目的在于研究三阴性MPN患者的分子学异常,通过新一代测序技术获得三阴性MPN疾病相关基因序列信息,为临床医生提供诊断依据。研究对象：1、收集2015年1月至2015年10月就诊于南方医院并诊断为Ph阴性的MPN患者骨髓标本10例,10例患者均已行Sanger测序法检测JAK2和CALR基因。4例JAK2V617F阳性患者,4例CALR基因突变阳性患者(2例CALR基因52bp缺失,2例CALR基因5bp插入),2例JAK2V617F和CALR基因突变同时存在的患者(1例CALR基因52bp缺失,1例CALR基因3bp缺失)。2、收集2015年1月至2015年10月就诊于南方医院并确诊为Ph阴性的MPN患者骨髓标本10例,10例患者均已经Sanger测序法检测JAK2和CALR基因阴性,ET病人骨髓标本6例,CNL病人骨髓标本1例,PMF病人骨髓标本3例。研究方法：1、筛选目的基因、定制MPN多重PCR引物试剂盒利用Ion AmpliSeq Designer引物设计工具,对通过查阅大量文献获得的23个目标基因进行多重PCR引物设计,定制MPN多重PCR引物试剂盒。2、DNA提取按照DNA提取试剂盒说明书操作,提取骨髓细胞DNA。3、Sanger测序用经典的Sanger测序方法检测MPN患者的MPL基因突变情况。4、Ion Torrent PGM测序1)文库构建检测DNA浓度,加无酶水稀释到10ng/ul。按照试剂盒说明书操作,扩增目的基因DNA、消化引物、加barcode接头、纯化扩增文库,最后定量文库。2)模板制备分别在Ion OneTouch Two和Ion OneTouch ES仪器上进行乳液PCR和阳性模板富集。3) Ion Torrent PGM测序将制备的模板加至Ion 316芯片上,在PGM测序仪上测序,测序原始数据储存在Ion Torrent PGM服务器上,用ionreporter (ionreporter.thermofisher.com)软件对结果进一步分析。结果：1、Ion Ampliseq Designer设计MPN多重PCR引物用Ion Ampliseq Designer对23个MPN致病相关基因设计多重PCR引物,结果如下：该MPN panel大小为52.42kb,共有283个扩增子,可以覆盖97.28%的目标区域,PCR扩增在两管内完成,分别有145和138个扩增子,扩增子的长度在125bp和275bp之间。2、Sanger检测MPL突变情况对第一部分和第二部分共20例MPN患者的MPL基因进行Sanger测序,20例MPN患者MPL基因突变均为阴性。3、Ion Torrent PGM测序质控以一张316芯片为例,芯片中磁珠覆盖率为66%,产生原始测序数据236Mb。磁珠文库连接率为100%,其中33%磁珠连接多克隆文库,67%磁珠连接单克隆文库。所有单克隆文库中,除去1%测试片段,12%接头二聚体,10%低质量文库,最终有效单克隆文库为77%,有效读取片段共2,159,538个。片段平均读长为181bp,中位读长为196bp。不同位置的碱基平均读取准确度为99.3%。其中达到AQ20(与参考序列99%匹配)标准的数据为207 Mb。Ion Torrent PGM测序质量标准为：磁珠覆盖率60%,磁珠文库连接率80%,连接多克隆文库磁珠40%,测试片段5%。整张芯片测序质控达到Ion Torrent PGM测序质量标准。以样品P1为例,单个样品测序质控结果显示：读取71,322,697个碱基,能达到AQ20标准的碱基数为64,123,648,平均测序深度为1,302×。4、Ion Torrent PGM测序结果分析1)对10例已经用Sanger测序法检测JAK2、MPL和CALR三个基因的MPN患者进行Ion Torrent PGM测序,就JAK2、MPL、CALR三个基因而言,3例CALR基因52bp缺失均未被Ion Torrent PGM测序检出,其余测序结果与Sanger测序结果完全吻合。Ion Torrent PGM测序结果可以显示基因位置、突变类型、氨基酸的改变和测序深度,最重要的是Ion Torrent PGM测序能显示突变所占的比例,从而对肿瘤细胞负荷进行定量。2)10例三阴性MPN患者Ion Torrent PGM测序结果显示：1例ET患者未检测出基因突变,其余9例患者均检测到突变,突变个数为1.3个。其中最常见的为表观遗传修饰基因TET2突变,4例患者检测出TET2基因突变。1例慢性中性粒细胞白血病病人检测出CSF3RT618I突变。1例PMF患者检测出TP53基因突变。除此之外,突变还涉及剪接体基因、信号传导相关基因等。结论：1、本研究结合自己定制的MPN多重PCR引物试剂盒和Ion Torrent PGM测序平台,成功的建立了一套灵敏特异、快速、高通量的MPN致病相关基因突变检测方法。Ion Torrent PGM测序能对肿瘤细胞负荷进行定量,为临床医生评估患者治疗疗效提供了依据。2、Ion Torrent PGM测序平台对长片段的缺失检出存在缺陷,需要进一步优化平台。3、几乎所有的三阴性MPN患者都存在基因突变,其中表观遗传修饰基因TET2突变最常见。此外突变还涉及剪接体基因、信号传导相关基因等。
【关键词】：骨髓增殖性肿瘤 基因突变 Ion Torrent PGM 测序
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.3
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 高通量测序平台在骨髓增殖性肿瘤临床诊断中的方法学建立16-48
• 前言16-21
• 1 材料和方法21-33
• 2 结果33-44
• 3 讨论44-48
• 第二章 高通量测序技术检测三阴性骨髓增殖性肿瘤基因突变48-64
• 前言48
• 1 材料和方法48-49
• 2 结果49-53
• 3 讨论53-64
• 参考文献64-79
• 全文小结79-80
• 攻读硕士学位期间成果80-81
• 致谢81-82

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本文编号：1070174