人B7-H4受体及其抗体的检测和研究

发布时间：2017-10-21 10:05

  本文关键词：人B7-H4受体及其抗体的检测和研究

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【摘要】：B7-H4又称为B7x或B7S1,是近来发现的B7家族新成员,在T细胞介导的免疫应答中起着重要的负性调节的作用。B7-H4的mRNA广泛表达于人的外周组织,包括胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏等,而B7-H4蛋白在细胞表面的表达是受限的。研究发现B7-H4在多种肿瘤组织中表达,包括肺癌、卵巢癌、胃癌等,其被认为是一种肿瘤标志物,与肿瘤的发生发展密切相关。目前,B7-H4受体尚未被克隆,Sica等通过构建B7-H4.Ig融合蛋白,采用流式细胞技术分离健康人新鲜T淋巴细胞,发现B7-H4.Ig不能与其结合,但经过体外活化刺激后约有20%-30%的结合,证实在活化T细胞上有B7-H4受体的表达。目前虽不清楚B7-H4与活化T细胞上B7-H4受体是如何相互作用改变信号通路下调T细胞的活化、增殖与细胞因子的分泌,但已有文献报道,B7-H4分子与其受体结合后可抑制ERK、JNK、p38、AKT等分子活性,进而影响T细胞的活化。本科室采用B7-H4-Fc融合蛋白进行流式细胞检测,在肺癌组织浸润的T细胞、肺癌细胞转移的淋巴结来源的T淋巴细胞、炎症组织浸润的扁桃体细胞上检测到B7-H4受体的表达。本研究将通过采用Magrose-NHS磁珠和构建溴化氢活化琼脂糖4B亲和层析柱,从扁桃体、Jurkat细胞中分离纯化B7-H4受体蛋白并对其鉴定。利用免疫组化、免疫荧光检测B7-H4受体在Jurkat细胞和炎症浸润的扁桃体中的表达及定位,为以后探索B7-H4受体分子在肿瘤浸润T细胞上的表达打下基础。一、人B7-H4受体的分离与鉴定【目的】大量纯化B7-H4受体并对其检测,为以后研究B7-H4受体分子提供基础。【方法】通过采用Magrose-NHS磁珠和构建溴化氢活化琼脂糖4B亲和层析柱,从扁桃体细胞、Jurkat细胞中分离纯化B7-H4受体蛋白,通过SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色和脱色,观察目的蛋白条带。将洗脱蛋白包板,利用ELISA鉴定纯化蛋白中是否含有B7-H4受体。【结果】采用Magrose-NHS磁珠从扁桃体细胞裂解上清中成功分离纯化出B7-H4受体,经SDS-PAGE考染后条带位于170KD上方,将洗脱蛋白包板,ELISA检测发现与B7-H4-Fc-Bio、10A10-Bio反应为阳性(P0.05)。成功构建溴化氢活化琼脂糖4B-10A10层析柱,大量分离纯化B7-H4受体,经SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色后在170KD上方发现目标蛋白,将洗脱蛋白包板后,利用ELISA方法检测发现同样与B7-H4-Fc-Bio、10A10-Bio均有阳性结果,经Graph Pad Prism分析,P0.05,有统计学意义。因此,洗脱蛋白中含有B7-H4受体。【结论】采用Magrose-NHS磁珠和溴化氢活化琼脂糖4B-10A10亲和层析柱均分离纯化得到B7-H4受体蛋白,为进一步研究B7-H4受体生物学功能奠定基础。二、利用B7-H4受体的抗体10A10检测B7-H4受体在细胞和组织中的表达【目的】本研究通过分析B7-H4受体在Jurkat细胞和炎症浸润的扁桃体细胞中的表达及定位,为以后探索B7-H4受体分子在肿瘤浸润T细胞上的表达打下基础。【方法】制备扁桃体冰冻切片,利用免疫组化、免疫荧光检测Jurkat细胞、扁桃体分选出的部分淋巴细胞和扁桃体冰冻切片中B7-H4受体的表达及定位。【结果】组化结果显示,在Jurkat细胞、扁桃体分选出的部分淋巴细胞膜表面有散在分布的棕色区域。扁桃体冰冻切片中,有阳性棕色颗粒呈弥散型分布。免疫荧光结果显示,Jurkat细胞、扁桃体分选出的部分B淋巴细胞膜和扁桃体冰冻切片中均呈现红色荧光,与阴性有强烈的对比。【结论】B7-H4受体在Jurkat细胞、扁桃体分选出淋巴细胞和扁桃体冰冻切片中均有分布,且定位在细胞的细胞膜上。
【关键词】：B7-H4 B7-H4受体 SDS-PAGE 免疫组化 免疫荧光
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.43
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 研究背景10-24
• 1. B7-H4分子的结构特征11-12
• 2. B7-H4分子表达特征12-13
• 3. B7-H4对T细胞的抑制13
• 4. B7-H4的潜在机制和信号通路13-15
• 5. B7-H4在肿瘤微环境中的作用15-16
• 6. B7-H4分子在肿瘤组织上的表达16-19
• 7. B7-H4分子受体的研究进展19-20
• 参考文献20-24
• 第一部分 人B7-H4受体的分离与鉴定24-39
• 1. 实验试剂与材料24-26
• 2. 实验方法26-30
• 3. 实验结果30-36
• 讨论36-37
• 参考文献37-39
• 第二部分 利用B7-H4受体的单抗 10A10检测B7-H4受体在细胞和组织中的表达39-46
• 1. 材料与仪器39-40
• 2. 实验方法40-41
• 3. 实验结果41-43
• 讨论43-45
• 参考文献45-46
• 总结与展望46-47
• 英文缩略词表47-49
• 致谢49-50

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本文编号：1072715