普洱茶联合化疗药物的增敏及保护作用研究

发布时间：2017-10-21 23:32

  本文关键词：普洱茶联合化疗药物的增敏及保护作用研究

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【摘要】：癌症已成为人类健康的头号威胁,严重的影响着人们的生活。而乳腺癌作为女性中最常见的肿瘤,给全球许多女性和家庭带来了不安。世界范围内,每年近50万女性死于乳腺癌的数据,也在警示着我们这种癌症的危害性。而我国的统计数据表明,每年新增的乳腺癌病例数高居所有癌症发病数的第二位,而随着诊断技术的提高,这个数据仍会不断升高。过去的半个多世纪里,化疗药物的发现、发展、改进给无数的患者及家庭带来希望,并在很大程度上改善了患者的生活质量,延长了患者的寿命,成为临床医生很好的帮手。但化疗药物较多的副作用,如恶心、呕吐、免疫力低下、心脏毒性、基因毒性等,同样给患者带来痛苦,因此也限制了其更好地为人类服务的本意。虽然科学家们和临床医生都想尽办法的改进、降低其副作用,但效果却不甚理想。目前为止,化疗药物的副作用仍是医生和患者面临的重大挑战。作为云南产量丰富的普洱茶,不仅有着悠久的饮用历史,其多种保健功能也逐渐的被发现、应用起来。近年来发现的其抗肿瘤、防癌的功效,更是吸引了大量研究人员和临床医生的注意。本实验室之前的研究发现,普洱茶可以通过降低突变p53的表达,来抑制携带突变p53的小鼠肿瘤细胞的生长,从而起到抑制肿瘤发展的作用。而普洱茶联合化疗药物针对人肿瘤细胞及正常细胞的研究相对有限,于是本课题以乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-468,乳腺正常上皮细胞MCF-10A,结肠癌细胞HT-29为研究对象,研究普洱茶联合化疗药物——阿霉素、顺铂、环磷酰胺、紫杉醇对这些细胞的作用。我们首先通过黄酰罗丹明B比色法检测(Sulforhodamine B, SRB实验)普洱茶联合这些化疗药物对细胞增殖的影响。结果表明,普洱茶联合阿霉素后,不影响阿霉素对乳腺癌细胞系T47D、 MDA-MB-468、结肠癌细胞HT-29的杀伤作用,而能显著改善阿霉素对正常细胞MCF-10A的毒害作用。同时,我们在显微镜下观察了普洱茶联合阿霉素及阿霉素单独处理MCF-10A细胞的增殖情况,也发现联合处理后,存活的细胞数明显的增多,表明联合处理确实降低了阿霉素对正常细胞的杀伤。而对普洱茶联合顺铂、环磷酰胺、紫杉醇的研究则表明,普洱茶对正常细胞MCF-10A则没有明显的保护作用。我们从分子水平上进一步探讨这种保护作用的机理。Western blot的结果表明普洱茶联合阿霉素后,阿霉毒引起的凋亡信号通路中的蛋白：Caspase8、 Caspase3、PARP的切割均显著减少。表明这种保护作用是通过降低阿霉素引起的细胞凋亡来实现。同时,由于阿霉素是DNA毒性药物,所以我们探索了DNA损伤信号通路的变化情况。如我们预料的一样,普洱茶联合阿霉素后DNA损伤的标志γ-H2AX、p53及磷酸化p53(p-p53)的表达均显著降低。这些结果表明,联合处理后阿霉素对细胞DNA的损伤明显降低。提示我们DNA损伤的降低可能也对这种保护起到一定作用。我们还采用了脉冲场凝胶电泳实验来进一步证实DNA损伤的情况,结果与western blot的一致。由于怀疑到普洱茶可能会通过与阿霉素相互作用,从而影响阿霉素进入细胞或者降低阿霉素对正常细胞的杀伤,所以我们设计了荧光实验来评价这种可能性。荧光实验的结果表明,普洱茶未影响阿霉素进入细胞。我们又试图通过高效液相色谱层析技术(HPLC)来确认两者间的作用。但由于我们使用的药物浓度低于HPLC检测的限度,所以未能确认两者是否有相互作用。此外,我们还初步探索了普洱茶对携带突变p53的乳腺癌细胞T47D、结肠癌细胞HT-29中突变p53表达情况的作用,未发现有明显的影响。在对普洱茶中几种成分槲皮素、EGCG、咖啡因、没食子酸等联合阿霉素处理MCF-10A的初步探索中,亦未发现其有保护作用,表明普洱茶联合阿霉素后的保护作用可能是普洱茶中其他成分发挥的作用。综上所述,普洱茶联合阿霉素后可以降低阿霉素对正常细胞的毒害,而不影响阿霉素对肿瘤细胞的杀伤,且这种作用不是通过阻止阿霉素进入细胞来实现的,而是通过降低阿霉素引起的细胞凋亡及DNA损伤来实现的。普洱茶在联合其他化疗药物时,则没有明显的作用。该研究为利用普洱茶联合阿霉素进行后续的动物实验,提供了坚实的基础。
【关键词】：普洱茶 化疗药物 细胞凋亡 DNA损伤
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-16
• 第一章 前言16-36
• 1.1 癌症及乳腺癌现状16-17
• 1.2 乳腺癌分类17-21
• 1.2.1 乳腺癌的临床应用分类17-19
• 1.2.2 乳腺癌的组织化学及分子生物学分类19-21
• 1.3 乳腺癌的治疗21-25
• 1.3.1 手术治疗与放射治疗22
• 1.3.2 内分泌治疗22
• 1.3.3 分子靶向治疗22-23
• 1.3.4 化学药物治疗23-25
• 1.4 p53与乳腺癌25-27
• 1.4.1 p53简介25-26
• 1.4.2 p53在乳腺癌发生中的作用26
• 1.4.3 p53状态的乳腺癌预后意义26-27
• 1.5 普洱茶27-34
• 1.5.1 普洱茶简介27-28
• 1.5.2 普洱茶形成过程中的微生物28
• 1.5.3 普洱茶的化学成分28-30
• 1.5.4 普洱茶的功效30-34
• 1.6 本论文的研究意义34-36
• 第二章 实验材料36-50
• 2.1 细胞系36
• 2.2 实验所用主要仪器设备36-37
• 2.3 实验所用主要耗材及试剂37-40
• 2.3.1 实验耗材37-38
• 2.3.2 实验所用主要试剂38-40
• 2.4 各种试剂的配制方法40-50
• 第三章 实验方法50-62
• 3.1 蛋白免疫印迹(western blot)50-55
• 3.1.1 总蛋白提取50
• 3.1.2 蛋白定量50-51
• 3.1.3 SDS-PAGE电泳体系配制51
• 3.1.4 SDS-PAGE电泳51-53
• 3.1.5 Western Blot——转膜53
• 3.1.6 封闭53
• 3.1.7 一抗孵育53-54
• 3.1.8 二抗孵育54
• 3.1.9 显影54
• 3.1.10 抗体的剥离54-55
• 3.2 细胞培养55-57
• 3.2.1 细胞的复苏55
• 3.2.2 细胞传代55-56
• 3.2.3 细胞冻存56-57
• 3.3 细胞收集57-58
• 3.4 SRB法检测细胞增殖58-59
• 3.5 脉冲场凝胶电泳实验(Pulsed-field gel electrophoresis)59-60
• 3.6 荧光实验60-61
• 3.7 高效液相色谱实验(HPLC)61-62
• 第四章 结果与讨论62-80
• 4.1 普洱茶联合阿霉素对乳腺癌细胞系、结肠癌细胞及正常乳腺上皮细胞的影响62-64
• 4.2 普洱茶联合顺铂、紫杉醇、环磷酰胺等对肿瘤细胞及正常细胞的作用64-66
• 4.3 显微镜下观察阿霉素、普洱茶、及联合处理正常乳腺上皮细胞MCF-10A的结果66-68
• 4.4 普洱茶联合阿霉素后起到的对正常细胞的保护作用是通过降低阿霉素引起的细胞凋亡来实现的68-69
• 4.5 普洱茶联合阿霉素后起到的对正常细胞的保护作用是通过减少阿霉素引起的细胞DNA的损伤来实现的69-71
• 4.6 脉冲场电泳实验也表明普洱茶联合阿霉素后起到的对正常细胞的保护作用是通过减少阿霉素引起的细胞DNA的损伤来实现的71-72
• 4.7 荧光实验表明普洱茶并未影响阿霉素进入细胞发挥作用72-73
• 4.8 高效液相色谱实验检测普洱茶与阿霉素混合后的相互作用情况73-75
• 4.9 普洱茶未见对肿瘤细胞系内突变p53的表达有明显的影响75-76
• 4.10 槲皮素、EGCG、咖啡因、没食子酸等联合阿霉素后未见有明显保护作用76-80
• 第五章 总结与展望80-82
• 5.1 总结80
• 5.2 展望80-82
• 致谢82-84
• 参考文献84-90
• 附录A 硕士期间发表的论文90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 龚加顺;陈文品;周红杰;董兆君;张以芳;;云南普洱茶特征成分的功能与毒理学评价[J];茶叶科学;2007年03期

2 娄莹;黄韬;;乳腺癌靶向治疗进展[J];肿瘤学杂志;2009年09期

3 梁名志;夏丽飞;陈林波;方成刚;段志芬;陈继伟;杨盛美;孙荣琴;;普洱茶渥堆发酵过程中理化指标的变化研究[J];中国农学通报;2006年10期

4 刘晓;邵方元;陈宏远;;阿霉素抗肿瘤分子机制的研究进展[J];中国医药生物技术;2012年05期

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本文编号：1075764