秦皮乙素对人肝癌细胞Wnt信号通路的影响

发布时间：2017-10-23 16:06

  本文关键词：秦皮乙素对人肝癌细胞Wnt信号通路的影响

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【摘要】：目的：检测秦皮乙素(Esculetin)对人肝癌细胞的增殖影响以及对Wnt通路中β-catenin、C-myc和Cyclin D1基因和蛋白的表达影响,初步探讨其抗肿瘤机制。方法：1.采用细胞病变法(Cytopathologic Effect, CPE)观察秦皮乙素对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用。用噻唑蓝比色法(3-(4,5-dimethyithiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)来测定秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721和人肝细胞HL-7702的抑制率。2.采用荧光定量PCR技术检测秦皮乙素在不同浓度,不同时间点对β-catenin、 C-myc和Cyclin D1基因合成的影响。3.通过蛋白免疫印迹法检测秦皮乙素对磷酸化β-catenin、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表达的影响。结杲：1.秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721有增殖抑制作用,抑制效果与时间和浓度呈依赖关系。秦皮乙素与顺铂对肝癌细胞SMMC-7721的抑制率相同时,秦皮乙素对正常肝细胞HL-7702的毒性更低。2.药物作用人肝癌细胞SMMC-772148h和72h后,秦皮乙素与细胞对照组相比能显著降低β-catenin、C-myc和Cyclin D1基因的合成(P0.05)。3.秦皮乙素作用人肝癌细胞SMMC-7721 24h后能提高P-catenin蛋白的磷酸化水平；秦皮乙素作用人肝癌细胞SMMC-7721 72h后降低了β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白的表达量。结论：1.秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721有增殖抑制作用,抑制效果与时间和浓度呈依赖关系。2.秦皮乙素通过上调P-catenin蛋白的磷酸化水平,促进P-catenin的降解,抑制Wnt通路的激活。3.秦皮乙素通过下调β-catenin、C-myc和Cyclin D1基因和蛋白的表达来抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。
【关键词】：秦皮乙素 SMCC-7721 Wnt信号通路 β-catenin C-myc Cyclin D1
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要8-9
• 文献综述9-18
• 1 肝癌9-10
• 1.1 肝癌概述9
• 1.2 中药抗癌途径9-10
• 1.2.1 直接杀伤肿瘤细胞9
• 1.2.2 诱导细胞分化9-10
• 1.2.3 诱导细胞凋亡10
• 1.2.4 抑制肿瘤血管的生成10
• 1.2.5 调节细胞信号传导通路10
• 2 Wnt通路10-15
• 2.1 Wnt通路概述10-11
• 2.2 Wnt通路中相关因子在不同肿瘤中的表达11-15
• 3 秦皮乙素的研究进展15-18
• 3.1 秦皮乙素的理化特征15-16
• 3.2 秦皮乙素的药理活性16-18
• 3.2.1 抗炎镇痛作用16
• 3.2.2 抗肿瘤作用16
• 3.2.3 抗氧化和清除自由基作用16-17
• 3.2.4 抗病原微生物作用17
• 3.2.5 抗凝和抗过敏作用17
• 3.2.6 其他作用17-18
• 前言18-19
• 1 试验材料19-22
• 1.1 主要试剂19
• 1.2 试剂配制19-21
• 1.3 试验仪器21
• 1.4 试验药物21
• 1.5 细胞21-22
• 1.5.1 来源21-22
• 1.5.2 细胞培养22
• 1.5.3 细胞传代22
• 1.5.4 细胞冻存22
• 1.5.5 复苏细胞22
• 2 试验方法22-29
• 2.1 秦皮乙素药效学检测22-23
• 2.1.1 药物的溶解和配制22-23
• 2.1.2 MTT法测定抑制率23
• 2.1.3 观测肝癌细胞SMMC-7721病变效应23
• 2.1.4 分组设置23
• 2.2 普通PCR检测目的基因23-25
• 2.2.1 引物设计23-24
• 2.2.2 样品制备24
• 2.2.3 提取细胞总RNA24
• 2.2.4 合成cDNA24-25
• 2.3 荧光定量PCR检测目的基因25-26
• 2.4 Western blot26-29
• 2.4.1 总蛋白样品的制备26-27
• 2.4.2 磷酸化蛋白的提取27
• 2.4.3 BCA法测定蛋白浓度27
• 2.4.4 SDS-PAGE电泳27-28
• 2.4.5 转膜28
• 2.4.6 封闭28
• 2.4.7 一抗孵育28-29
• 2.4.8 二抗孵育29
• 2.4.9 蛋白检测29
• 2.4.10 数据统计与分析29
• 3 结果29-39
• 3.1 秦皮乙素的药效作用29-32
• 3.1.1 秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721和人肝细胞HL-7702增殖的影响29-31
• 3.1.2 秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721导致的病变31-32
• 3.2 荧光定量PCR测定结果32-38
• 3.2.1 人肝癌细胞SMMC-7721总RNA提取与检测32
• 3.2.2 普通PCR电泳验证目的基片段32-33
• 3.2.3 荧光定量PCR目的基因特异性验证33-34
• 3.2.4 荧光定量PCR产物测序验证34
• 3.2.5 不同时间点秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721β-catenin基因表达量的影响34-36
• 3.2.6 不同时间点秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721 C-myc基因表达量的影响36-37
• 3.2.7 不同时间点秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721 Cyclin D1基因表达量的影响37-38
• 3.3 Western blot测定结果38-39
• 3.3.1 BCA蛋白浓度测定结果38
• 3.3.2 秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721磷酸化蛋白β-catenin表达量的影响38
• 3.3.3 秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721 β-catenin蛋白表达量的影响38-39
• 3.3.4 秦皮乙素对人肝癌细胞SMMC-7721 C-myc和Cyclin D1蛋白表达量的影响39
• 4 分析与讨论39-42
• 4.1 秦皮乙素的细胞毒性和抗癌活性39-40
• 4.2 秦皮乙素通过上调β-catenin磷酸化蛋白表达水平而下调其β-catenin总蛋白的表达40-41
• 4.3 秦皮乙素通过降低C-myc和CycliD1在基因和蛋白水平上的表达而发挥抗肿瘤作用41-42
• 5 结论42-43
• 参考文献43-48
• Abstract48-50
• 致谢50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 刘树立;徐洪涛;杨连赫;李庆昌;韦强;王恩华;;Axin过表达下调β-catenin和TCF-4表达并抑制肺癌BE1细胞的增殖和侵袭[J];中国肺癌杂志;2009年04期

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3 柯长洪;彭元;陈伟;蔡继业;;雷公藤红素抑制血管内皮细胞增殖的AFM研究[J];生物技术;2011年04期

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中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 严晓莺;几种抗癌活性成分对人正常肝细胞LO2毒性的体外实验研究[D];南京中医药大学;2012年

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本文编号：1084208