α-GalCer负载DC激活CIK细胞对肝癌细胞的杀伤效应研究

发布时间：2017-10-24 05:42

  本文关键词：α-GalCer负载DC激活CIK细胞对肝癌细胞的杀伤效应研究

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【摘要】：研究背景：树突状细胞是迄今体内功能最强大的抗原提呈细胞,在免疫应答诱导中有独特的地位。CIK细胞是新型的免疫活性细胞,是由多种细胞因子诱导产生的杀伤细胞,具有T细胞的抗瘤活性和MHC限制性杀瘤的特点。CIK细胞和DC细胞是目前应用较多的过继免疫治疗的有效方法。α-半乳糖神经酰胺在临床试验中作为一种抗癌剂,对很多实体肿瘤均有效。肿瘤的临床实验表明,注射α-GalCer负载的DC比单独注射α-GalCer呈现出更大的抗肿瘤活性。但荷载α-GalCer的成熟DC对CIK细胞的功能活化还尚未见研究。本研究在以往研究的基础上,探索α-GalCer负载DC对CIK细胞的激活作用及杀伤活性的影响,为DC-CIK在肿瘤免疫治疗中的应用提供依据。目的：探讨α-GalCer负载对人外周血树突状细胞(DC)的激活作用及功能的影响；研究负载α-GalCer的DC能否在体外激活乙肝患者外周血中的NKT细胞；探讨α-GalCer-DC与CIK共培养对CIK细胞表型、增殖活性及杀伤肝癌细胞效率的影响。方法：(一)采用密度梯度离心法从人外周血中分离出单个核细胞,悬浮细胞诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导培养DC细胞,在光镜下观察其形态和生物学特征；流式细胞仪检测DC与CIK细胞的免疫表型。(二)流式细胞仪检测α-GalCer负载的DC细胞表型,qRT-PCR检测DC细胞相关基因的mRNA水平。 (三)采用DC和α-GalCer来诱导培养患者外周血NKT细胞,流式细胞仪检测NKT的免疫表型和细胞因子的表达水平。 (四)将α-GalCer-DC细胞与CIK细胞共培养,流式细胞仪检测DC与各组CIK细胞表面标志物；台盼蓝染色法检测各组CIK细胞的增殖倍数；qRT-PCR检测CIK细胞功能相关基因的表达情况；CCK-8试剂盒检测α-GalCer-DC对CIK细胞杀伤HepG2的影响。结果：1.经过多种细胞因子诱导,可获得CIK细胞和成熟的DC细胞。CIK细胞高表达CD3+CD8+和CD3+CD56+,成熟DC细胞高表达CD86, CD80, CD83和CDllc,低表达CD14。2.α-GalCer负载可促进DC细胞成熟,细胞表面标志物CD80, CD86, CD83, CD11c的阳性率均升高,表面趋化因子受体CCR-7、IL-12、IL-10的mRNA水平升高。3.DC和α-GalCer联合诱导培养患者外周血NKT细胞,可以获得高表达TCRVa24 TCRVβ11的双阳性NKT细胞,并使NKT分泌高水平的IL-4和INF-γ。4. α-GalCer-DC与CIK共培养,可显著提高CIK细胞CD3+CD56+的表达和增殖活性；可显著提高INF-γ、IL-12、穿孔素和颗粒酶素B的mRNA表达水平。CCK-8法检测各组CIK细胞的杀伤活性,在同一效靶比时,α-GalCer-DC-CIK细胞组对靶细胞的杀伤作用最强,明显高于CIK、DC-CIK细胞组,差异具有统计学意义(P0.01)。 CCK-8法检测结果显示：CIK细胞对肝癌细胞HepG2细胞有明显的细胞毒作用,其抑制率随着效靶比的增高而增高,并且具有显著性差异(p0.05)。结论：α-GalCer可以在DC表面有效递呈,提高DC的成熟度和活性；α-GalCer和DC可在体外激活NKT细胞；α-GalCer负载DC对CIK细胞增殖、表型及杀伤能力具有提升作用,能显著增强其对肝癌细胞的杀伤活性。
【关键词】：α-GalCer DC CIK细胞 NKT细胞 肿瘤杀伤活性
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符号说明10-11
• 前言11-17
• 第一节 α-GalCer负载对人外周血树突状细胞的激活作用17-25
• 一、试剂和仪器17-19
• 二、实验方法19-21
• 三、实验结果21-23
• 四、讨论23-25
• 第二节 α-GalCer负载DC对体外扩增慢性乙型肝炎患者外周血NKT细胞的影响25-32
• 一、试剂和仪器25-26
• 二、实验方法26-28
• 三、实验结果28-29
• 四、讨论29-32
• 第三节 α-GalCer负载DC对CIK细胞的激活作用及杀伤活性的影响32-42
• 一、试剂和仪器32-34
• 二、实验方法34-36
• 三、实验结果36-40
• 四、讨论40-42
• 结论42-43
• 参考文献43-49
• 致谢49-50
• 攻读学位期间发表的学位论文50-51
• 学位论文评阅及答辩情况表51

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本文编号：1087331