BTBD10对人脑胶质瘤替莫唑胺化疗敏感性的影响及机制探讨
本文关键词：BTBD10对人脑胶质瘤替莫唑胺化疗敏感性的影响及机制探讨
更多相关文章： 胶质母细胞瘤 替莫唑胺 半抑制浓度 化疗敏感性 增殖 侵袭 凋亡 化疗耐药
【摘要】：脑胶质瘤大约占原发性脑肿瘤的40-50%,是中枢神经系统中最为常见的恶性肿瘤类型。尽管在过去的几十年中,医疗设备和手术技术得到了飞速发展,但是恶性胶质瘤所造成的死亡率和致残率仍然居高不下,其中5年生存率不足10%。特别是病理组织学中恶性程度最高的胶质母细胞瘤(GBM),预后最差。造成这种情况的原因有很多,包括肿瘤的弥漫浸润性生长方式、血脑屏障的影响、化疗药物剂量不足等等。与手术切除和放射治疗相比,化疗在提高胶质瘤患者生存时间上的贡献较为有限。其中化疗耐药性的存在是制约其疗效进一步提高的重要因素。目前胶质瘤干细胞,凋亡、自噬,多药耐药,DNA损伤修复是研究较为集中的化疗耐药机制。它们所涉及到的相关基因及信号转导通路机制尚不完全明了。而作为新一代烷化剂的替莫唑胺,虽然是目前临床上胶质瘤的标准化疗药物,但是对其敏感性及耐药性的差异导致患者预后的明显不同。所以,进一步深入研究关于胶质瘤化疗耐药性的相关分子调控机制,能够为提高患者的化疗疗效开辟新的道路。在先前的研究中,我们利用基因表达谱芯片对脑胶质瘤标本进行筛查分析,数据结果中发现含有BTB/POZ结构域的BTBD10表达量有显著下调。查阅文献获知,BTB/POZ蛋白家族成员参与多种细胞生理过程,其可能的作用机制包括介导蛋白质-蛋白质之间的自联,通过形成二聚体或多聚体选择性地与DNA相互作用,调节基因开关,参与基因的表达调控,以及细胞的增殖、分化、凋亡等功能。为此,前期我们以BTBD10作为研究对象,运用RT-PCR、Northern、Western-blot以及构建BTBD10慢病毒表达载体等技术手段,对各级别脑胶质瘤组织标本及U251细胞株进行了BTBD10表达量的鉴定以及检测它对细胞增殖和凋亡的影响。实验结果显示,相较于正常人脑组织,BTBD10的表达在各级别胶质瘤中均下调,并且其表达水平与肿瘤的恶性级别呈负相关,即级别越高表达量越低。同时,在过表达BTBD10的U251细胞中证实,BTBD10可以通过抑制PI3K/Akt信号通路的活性,抑制胶质瘤细胞的增殖,促进凋亡。因此,可以初步认为BTBD10作为抑癌基因可以成为胶质瘤治疗的潜在靶点。当然,要真正了解BTBD10的相关功能及作用机制还需要我们继续深入的研究。本实验拟于四个GBMs细胞株中筛选出BTBD10低表达者,通过慢病毒载体转染构建过表达BTBD10的GBMs细胞株,测定其对TMZ化疗的敏感性变化以及经TMZ处理后GBMs细胞株在增殖、侵袭、凋亡方面的改变。最后,通过检测凋亡、自噬、多药耐药、DNA修复这四种机制中的相关蛋白的表达水平,探讨过表达BTBD10引起的GBMs细胞株化疗敏感性变化的可能作用机制。实验分为二个部分:第一部分,慢病毒过表达BTBD10后对GBMs细胞株化疗敏感性的影响;第二部分,过表达BTBD10后U251、U87细胞株化疗敏感性变化的机制探讨。第一部分慢病毒过表达BTBD10后对GBMs细胞株化疗敏感性的影响目的:本部分实验旨在通过筛选GBMs细胞株,构建过表达BTBD10载体,验证过表达BTBD10后GBMs细胞株对TMZ化疗敏感性的变化。方法:应用Real-time PCR方法检测U87、U251、A172、U373这四个GBMs细胞株中BTBD10的m RNA表达水平。构建BTBD10过表达慢病毒载体,选择转染低表达BTBD10的两个细胞株,采用Real-time PCR和Western-blot方法检验转染效率。将U251及U87细胞均分为空白对照(CON)、空载(NC)及过表达(OE)BTBD10三组。依据CCK-8法测定的IC50值鉴别过表达BTBD10引起的胶质瘤细胞对TMZ的化疗敏感性变化。结果:四个GBMs细胞株中U251、U87的BTBD10m RNA表达量较低,与A172、U373之间均达到统计学差异(P㩳0.05)。成功构建BTBD10过表达慢病毒载体,转染U251、U87后BTBD10的m RNA表达水平分别为转染前的11.43倍和43.92倍。同时BTBD10蛋白表达水平也明显增高,与m RNA水平趋势一致。U251细胞中OE组、CON组和NC组细胞对TMZ的IC50值分别10.31mg/L、19.78mg/L、19.84mg/L。U87细胞中OE组、CON组和NC组细胞的IC50值分别为8.628 mg/L,16.36mg/L、16.71 mg/L。这两株细胞中,OE组的IC50值均明显低于CON组和NC组(P㩳0.05)。结论:BTBD10的表达水平与GBMs细胞对TMZ的化疗敏感性呈正相关,过表达BTBD10能够增加U251、U87细胞对TMZ的化疗敏感性。第二部分过表达BTBD10后U251、U87细胞株化疗敏感性变化的机制探讨目的:本部分实验研究过表达BTBD10后U251、U87细胞株的在增殖、侵袭、凋亡方面的变化并探讨肿瘤细胞对TMZ化疗敏感性增加的可能机制。方法:应用MTT法、Transwell法及流式细胞仪分别检测U251、U87三组细胞经TMZ诱导后的增殖情况、侵袭力及凋亡水平。同时,应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白BCL-2、Caspase3,自噬相关蛋白LC3、Beclinl,多药耐药蛋白ABCC1、ABCB1,损伤修复蛋白MGMT、ERCC2的表达水平。结果:MTT结果提示U251、U87细胞中根据OD490的变化倍数,OE组细胞的增殖倍数较CON组及NC组明显降低,达到统计学差异(P㩳0.05)。Transwell结果提示,在U251、U87细胞中OE组相比CON组及NC组转移细胞数无明显统计学差异(P㧐0.05)。流式细胞仪检测结果提示,U251、U87细胞中OE组相比CON组、NC组细胞凋亡率有明显上升,达到统计学显著差异(P㩳0.05)。耐药相关蛋白检测结果提示,U251、U87细胞过表达BTBD10时,Bcl-2、ABCC1、ABCB1表达减少,Caspase3表达升高,且OE组相比CON组、NC组的表达差异有统计学意义(P㩳0.05),而LC3、Beclin1、MGMT、ERCC2的表达无明显差异(P㧐0.05)。结论:过表达BDBT10的U251、U87细胞增殖能力受到抑制,凋亡水平增高,而细胞的侵袭能力并没有显著改变,并且其对TMZ的化疗敏感性变化可能是通过凋亡及多药耐药相关途径实现的。
【关键词】：胶质母细胞瘤 替莫唑胺 半抑制浓度 化疗敏感性 增殖 侵袭 凋亡 化疗耐药
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：
- 中文摘要5-8
- 英文摘要8-12
- 英文缩写词表12-14
- 第一部分 慢病毒过表达BTBD10后对GBMs细胞株化疗敏感性的影响14-44
- 一、前言14-15
- 二、材料和方法15-29
- 三、结果29-41
- 四、讨论41-44
- 第二部分 过表达BTBD10后U251、U87细胞株化疗敏感性变化的机制探讨44-60
- 一、前言44-45
- 二、材料与方法45-48
- 三、结果48-55
- 四、讨论55-60
- 全文总结60-61
- 参考文献61-68
- 综述：BTBD10 的研究现状与进展68-74
- 参考文献72-74
- 硕士期间发表文章和参加会议74-75
- 致谢75
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，本文编号：1108296
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