IL-6抑制单核细胞来源树突状细胞CCR7表达的机制研究

发布时间：2017-10-29 18:22

  本文关键词：IL-6抑制单核细胞来源树突状细胞CCR7表达的机制研究

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【摘要】：一、研究背景DCs在调节人体免疫平衡、清除感染、对抗肿瘤中发挥着重要作用。近年来随着对肿瘤认识不断深入,肿瘤免疫逃逸被认为是肿瘤发生、发展的重要原因之一。而树突状细胞与肿瘤免疫逃逸之间的关系是当前研究的热点。功能成熟的树突状细胞在摄取肿瘤抗原后可以激活CD8+T细胞,进而清除肿瘤细胞。在这个过程中,DCs需要高表达共刺激分子(CD86、CD80、CD83、CD40等),MHC-I类和MHC-II分子以及趋化因子受体7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)。共刺激分子与MHC类分子是DCs抗原提呈和激活T细胞的关键分子,缺少了它们的表达,T细胞就不能被有效激活。CCR7则是介导DCs迁移功能的最重要的趋化因子受体。在人体内,DCs广泛分布于人体淋巴器官和外周非淋巴组织(肝脏、皮肤、肾脏、胃肠等),而一旦被刺激成熟后,DCs上调表达CCR7,而CCR7在与配体CCL19或者CCL21结合后,介导成熟DCs沿输入淋巴管迁移到淋巴器官并通过共刺激分子和MHC类分子激活T细胞。所以DCs的迁移运动能力和刺激T细胞的能力都是激活特异性免疫的关键因素。在肿瘤发生发展的早期,树突状细胞通常能够有效激活T细胞去杀伤肿瘤细胞。但是随着肿瘤进一步发展,树突状细胞往往处于失能状态。肿瘤细胞通过与其他基质细胞相互作用、分泌免疫抑制因子等机制改变自身生存环境,形成具有促肿瘤生长、抑制免疫反应特点的肿瘤微环境(tumour microenvironment,TME)。而在肿瘤微环境中,树突状细胞的分化成熟和迁移能力被抑制的。在正常生理情况下,IL-6对树突状细胞生物学功能的发挥具有重要作用,但是肿瘤微环境中高水平的免疫抑制因子IL-6(interleukin-6)被证实是抑制树突状细胞分化成熟和迁移能力的重要因子。在肿瘤微环境中,IL-6能抑制DCs共刺激分子和MHC类分子的表达,并且抑制CD34+前体细胞向DCs分化。在肿瘤微环境中树突状细胞通常低表达CCR7,而高表达CCR6、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR4分子。而后者通常在不成熟树突状细胞和免疫耐受树突状细胞表面表达。而不成熟树突状细胞和免疫耐受树突状细胞都是具有免疫抑制性质的。CCR7表达的缺失被证实会导致树突状细胞迁移障碍,最终导致机体免疫缺陷。最近有学者报道肿瘤细胞来源的il-6明显抑制人单核细胞来源的树突状细胞(humanmonocyte-deriveddendriticcells,modcs)ccr7的表达和modcs的迁移能力,但其内在分子机制还不清楚。在某些类型的肿瘤组织(宫颈癌)中肿瘤基质里的树突状细胞高表达其成熟标志cd83,但是低表达或不表达ccr7。所以il-6通过抑制树突状细胞ccr7表达而阻止dcs向淋巴器官迁移,可能是导致肿瘤宿主免疫缺陷的原因之一。所以我们希望通过研究il-6抑制modcsccr7表达的内在分子机制,找到能够纠正modcs迁移功能障碍的分子靶点,为纠正肿瘤患者的免疫缺陷提供新的策略。二、研究方法1、采用磁珠分选(magnetic-activatedcellsorting,macs)法从人外周血中分选出cd14+单核细胞,使用含青链双抗的10%rpmi-1640培养基进行培养。培养条件为5%co2、37℃。并补充细胞因子rhgm-csf800u/ml、rhil-4500u/ml进行modcs的诱导分化。细胞每隔两天半量更换培养基,并补充丢失的rhil-4,rhgm-csf。在培养的第3天,加入不同剂量的il-6,使其终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml。在培养第6天,加入lps(100ng/ml)刺激48h后,收获modcs,流式分析检测cd86、cd83以及hla-dr的表达水平。定量rt-pcr检测ccr7mrna的表达。2、在第一部分实验的基础上,拟对il-6抑制modcsccr7表达的分子机制进行研究。由于il-6有两条关键的下游信号通路:gp130tyr759-shp-2/erk信号通路和gp130yxxq-jak/stat3信号通路,所以我们通过westernblotting检测il-6处理的modcs细胞内p-stat3和p-erk1/2的表达情况。3、在第二部分实验的基础上,我们使用了p-stat3抑制剂jsi-124与p-erk1/2抑制剂pd98059分别抑制il-6处理后modcs细胞内p-stat3和p-erk1/2的表达。定量rt-pcr分别检测jsi-124与pd98059对il-6抑制modcsccr7mrna表达的影响。流式分析检测jsi-124对il-6抑制modcsccr7表达的影响。transwell细胞迁移实验检测jsi-124对il-6抑制modcs迁移的影响。三、研究结果1、通过rhgm-csf、rhil-4联合诱导法,培养得到具有典型树突形态的人单核细胞来源树突状细胞。lps刺激获得成熟的树突状细胞。流式分析发现,终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6对modcs的表型成熟分子:cd86、cd83、hla-dr的表达没有抑制作用。il-6(50ng/ml)+lps组dc86/dc83/hla-dr表达率分别为90.1±1.2、81.2±1.5、94.6±1.8。il-6(100ng/ml)+lps组dc86/dc83/hla-dr表达率分别为96.2±1.6、86.9±0.9、87.7±1.3。il-6(150ng/ml)+lps组dc86/dc83/hla-dr表达率分别为91.3±1.2、91.0±1.6、87.0±1.7。与lps单独处理组(lps组dc86/dc83/hla-dr表达率分别为92.6±1.7、82.0±1.2、93.4±1.4)相比较无统计学差异(p0.05)。而定量rt-pcr检测发现终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6能明显抑制modcsccr7mrna的表达(ccr7mrna的相对表达量依次为0.760±0.079、0.440±0.029、0.435±0.059),并与lps单独处理组(1.246±0.102)相比较有统计学差异。(p0.05)。2、westernblotting检测发现il-6处理组modcsp-stat3、p-erk1/2的表达明显高于lps单独处理组。终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6处理组p-stat3的相对表达量依次为:1.240±0.092、1.438±0.105、1.875±0.127,与lps单独处理组(0.724±0.086)相比较有统计学差异(p0.05)。终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6处理组p-erk的相对表达量依次为:1.085±0.067、1.071±0.082、0.856±0.039,与lps单独处理组(0.359±0.024)相比较有统计学差异(p0.05)。3、westernblotting检测发现jsi-124和pd98059能分别抑制il-6导致的p-stat3和p-erk1/2过度活化。il-6(100ng/ml)+jsi-124组p-stat3相对表达量为0.841±0.018,低于il-6(100ng/ml)单独处理组(1.388±0.090)(p0.05)。il-6(100ng/ml)+pd98059组p-erk相对表达量为0.389±0.076,低于il-6100ng/ml单独处理组(0.688±0.082)(p0.05)。定量rt-pcr检测发现jsi-124能逆转il-6对modcsccr7mrna的表达,il-6(100ng/ml)+jsi-124+lps组moccr7mrna相对表达量为0.640±0.101,明显高于il-6(100ng/ml)+lps组(0.219±0.018)(p0.05)。pd98059却不能。il-6(100ng/ml)+pd98059+lps组moccr7mrna相对表达量为0.260±0.038,与il-6(100ng/ml)+lps组相比较无统计学差异(p0.05)。流式分析检测发现jsi-124能逆转il-6对modcsccr7表达的抑制,il-6(100ng/ml)+jsi-124+lps组modcsccr7表达率为83.0±1.2,明显高于il-6(100ng/ml)+lps组(15.4±0.9)(p0.05)。transwell细胞迁移实验检测发现jsi-124还能逆转il-6对modcs迁移的抑制,il-6(100ng/ml)+JSI-124+LPS组moDCs的迁移率为74.5±3.3,明显高于IL-6(100ng/ml)+LPS组(26.2±2.1)(P0.05)。四、研究结论1、IL-6对moDCs的表型成熟分子DC86、DC83、HLA-DR的表达没有抑制作用,而对moDCsCCR7mRNA的表达有明显抑制作用。2、IL-6能明显激活moDCs内STAT3信号通路和ERK信号通路。3、JSI-124抑制p-STAT3表达后,能逆转IL-6对moDCs CCR7mRNA表达的抑制,而p-ERK抑制剂PD98059却不能。而且JSI-124还能逆转IL-6对moDCsCCR7表达和迁移能力的抑制。结果提示IL-6通过STAT3信号通路,而不通过ERK信号通路抑制moDCsCCR7的表达和细胞迁移能力。STAT3可能成为干预moDCs迁移障碍的分子靶点,为纠正肿瘤患者的免疫缺陷提供理论支撑。
【关键词】：IL-6 人单核细胞来源树突状细胞 树突状细胞 肿瘤微环境 细胞趋化因子受体7 信号转导和转录激活因子3 细胞外调节蛋白激酶
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.3
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-17
• 第二章 体外建立IL-6 抑制人外周血单核细胞来源树突状细胞CCR7表达模型17-34
• 2.1 材料和方法17-25
• 2.2 实验结果25-30
• 2.3 讨论30-33
• 2.4 小结33-34
• 第三章 IL-6 对单核细胞来源树突状细胞内STAT3信号通路和ERK信号通路的影响34-43
• 3.1 材料和方法34-38
• 3.2 实验结果38-40
• 3.3 讨论40-42
• 3.4 小结42-43
• 第四章 STAT3信号通路和ERK信号通路在IL-6 抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达中的作用43-60
• 4.1 材料和方法43-53
• 4.2 实验结果53-57
• 4.3 讨论57-59
• 4.4 小结59-60
• 全文结论60-61
• 参考文献61-66
• 文献综述 肿瘤微环境中IL-6 与树突状细胞的研究进展66-74
• 参考文献71-74
• 硕士期间发表的论文74-75
• 致谢75

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