GAB调控端粒酶组装及肿瘤细胞衰老的研究

发布时间：2017-10-30 21:17

  本文关键词：GAB调控端粒酶组装及肿瘤细胞衰老的研究

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【摘要】：细胞衰老(Cell senescence)是处于活性生长状态的细胞脱离细胞周期且不可逆的丧失增殖能力后所进入的一种生长停滞的相对稳定状态,是正常细胞的必然归宿,这种现象在生物体中是普遍存在的。细胞衰老主要分为复制性衰老与胁迫诱导的早熟性衰老,本研究则重点讨论细胞复制性衰老。细胞在复制性衰老过程中会发生许多变化,如细胞生长速度减缓、细胞周期阻滞、端粒缩短、DNA损伤,但是其中最重要的变化就是端粒缩短,端粒缩短被认为是DNA复制性衰老的根本原因。目前发现的能够阻滞细胞复制性衰老、防止端粒缩短促进端粒延长的细胞大多为肿瘤细胞与干细胞,其延长端粒的机制主要有两种:(1)依赖延长端粒的酶即端粒酶来延长端粒;(2)通过ALT途径延长端粒,其中ALT途径主要发生于一些缺乏端粒酶但表达hTR的细胞中,它们能通过重组的方式延长端粒,而表达端粒酶的细胞则主要依靠端粒酶去延伸端粒。调控端粒酶活性的方式有许多种,可以在转录或翻译水平调控hTERT、hTR、Dyskerin等端粒酶复合体的组分,也可以通过调控端粒酶的组装而调控端粒酶。本研究发现细胞核仁内存在一种蛋白—GAB,它就是通过调控端粒酶组装而调控端粒酶活性,最终调控端粒长度导致细胞复制性衰老。目前的研究对于端粒酶组装的分子机制阐述得不够清晰,新的调控蛋白与调控机制有待发现,其在细胞复制性衰老中的功能和意义有待明确。我们实验室前期在研究GAB基因时发现,在敲低GAB的稳定细胞系中,随着传代次数的增加,细胞生长速度明显减缓,且细胞逐渐变大变扁平,因此,我们猜测细胞可能发生了衰老。于是我们在多种端粒酶阳性细胞中敲低GAB后测定细胞生长发现,细胞生长速度都有减缓,但是在端粒酶阴性的U2OS细胞中过表达GAB或者hTERT或者GAB与hTERT共转都不会改变细胞生长速度。同时我们针对这些端粒酶阳性的肿瘤细胞进行了BrdU掺入实验,发现细胞周期阻滞在了G1/S期;后来我们在MCF-7细胞中构建长期稳定敲低GAB的单克隆细胞系,通过SA-β-Gal染色发现,长期稳定敲低GAB后细胞发生衰老,而长期过表达GAB的细胞却很少衰老;既然GAB与细胞生长、细胞周期以及衰老均有联系,那么GAB是否与DNA损伤相关?我们利用IF检测了DNA损伤的几个标志物(γH2AX、p-ATM、53BP1、p-Chk1、p-Chk2),发现在细胞内这几种标志物均形成了焦点样定位,表明DNA发生了损伤,且通过对γH2AX与HP1α共染发现,发生DNA损伤的细胞即为衰老的细胞。为了验证细胞是否发生复制性衰老,我们通过Southern Blotting实验发现,在MCF-7、HT1080细胞长期敲低GAB后,端粒长度缩短,证明细胞发生复制性衰老。那么,GAB是如何调控端粒长度的呢?我们通过Co-IP、GST Pull-Down、RIP、EMSA等实验技术,发现GAB直接结合hTERT与hTR,进一步研究发现GAB通过其BRCT结构域(311-415)与hTERT的500-900区段直接结合,同时GAB通过hTR介导结合hTERT的234-500区段与Dyskerin,通过其221-322区段结合hTR的60-360区段。GAB与端粒酶主要复合体存在相互作用,那么GAB是否可以调控端粒酶活性?我们在体内与体外通过TRAP实验均证明了GAB能够升高端粒酶活性,其发挥功能的主要区域为BRCT结构域。而且GAB的IP复合体具有较高的端粒酶活性。关于端粒酶活性,最后我们在GAB转基因鼠中也证明了转GAB基因鼠的端粒酶活性明显高于野生型小鼠。接下来我们研究了GAB调控端粒酶活性的具体机制。我们首先利用WB与qRT-PCR技术,发现了GAB不改变hTR、h TERT、Dyskerin的表达,但是通过RIP与GST Pull-Down、His Pull-Down等实验发现了在体内与体外GAB均通过其BRCT结构域促进hTR与hTERT的结合。在细胞内敲低GAB会使端粒酶组装复合体中许多成分的结合发生变化,敲低GAB会抑制Dyskerin与hTR、Dyskerin与hTERT的结合,但不改变负责端粒酶运输的蛋白TCAB1与hTERT的结合。另外,敲低GAB会促进hTERT在核仁的定位。由于端粒酶组装有利于hTERT出核仁,因此,GAB能改变hTERT核仁定位的特性这一发现进一步提示GAB与端粒酶组装相关。目前,已发现的调节hTERT与hTR结合的蛋白因子为一对ATP酶—Pontin与Reptin,通过IP实验与TRAP实验,我们发现GAB与Pontin和Reptin之间不存在相互作用,且GAB调控端粒酶活性与Pontin和Reptin之间也没有依赖关系,所以可以认为GAB参与形成的端粒酶复合体不同于已报道的Pontin、Reptin参与形成的端粒酶复合体。最后,我们检测了p53在GAB对端粒酶调控中所起的作用,首先在ZR75-1细胞中我们通过TRAP实验发现过表达p53可以促进细胞的端粒酶活性,且通过TRAP实验我们还发现了GAB调节端粒酶活性部分依赖p53。通过GST PullDown实验发现,GAB与p53存在直接相互作用。通过RIP实验证明,在HCT116p53+/+细胞中,敲低GAB后可以抑制hTERT与hTR的结合,但在HCT116 p53-/-细胞中,敲低GAB后抑制hTERT与hTR的结合能力丧失。综上所述,我们首次发现了由GAB参与的一个新的端粒酶组装复合体,我们同时解析了GAB在端粒酶复合体中的定位与调节端粒酶组装的机制,以及GAB发挥功能的主要结构域。此外,我们还发现了GAB能调节复制性衰老,这为我们进一步了解端粒酶及细胞复制性衰老奠定了基础。
【关键词】：细胞衰老 端粒酶 GAB BRCT结构域
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3;Q78
【目录】：

• 缩略词表7-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 前言14-20
• 材料和方法20-61
• 1 材料20-24
• 1.1 菌株与细胞株20
• 1.2 实验用质粒20
• 1.3 实验所用的试剂盒20-21
• 1.4 细胞培养试剂21
• 1.5 分子生物学试剂与其它化学试剂21-22
• 1.6 抗体22-23
• 1.7 实验所用的主要器材与设备仪器23-24
• 2 实验方法24-57
• 2.1 Southern Blotting测定端粒长度24-27
• 2.2 TRAP测定端粒酶活性（选用Millipore试剂盒）27-30
• 2.3 Flag-h TERT蛋白的体外翻译30
• 2.4 hTR及其突变体的体外转录30-32
• 2.5 端粒酶活性体外重构实验32
• 2.6 细胞培养32-34
• 2.7 原代MEF细胞的分离34-35
• 2.8 细胞转染与病毒的包装、感染35-38
• 2.9 细胞生长曲线测定38-39
• 2.10 Brd U掺入实验39
• 2.11 分子克隆39-45
• 2.12 GAB稳定细胞系构建45
• 2.13 蛋白印记45-48
• 2.14 Co-IP48-49
• 2.15 GST Pull-Down49-51
• 2.16 蛋白与RNA体外结合实验51
• 2.17 RIP51-52
• 2.18 ChIP52-53
• 2.19 IF53-54
• 2.20 SA-β-Gal染色54
• 2.21 转基因小鼠鉴定54-55
• 2.22 免疫组化55-56
• 2.23 RNA-EMSA56-57
• 3 在读期间构建的质粒克隆57-61
• 结果61-114
• 第一部分 GAB在肿瘤与衰老中的功能研究61-71
• 1 GAB与细胞生长的关系61-63
• 1.1 GAB促进端粒酶阳性肿瘤细胞生长61-62
• 1.2 GAB与hTERT均不调控端粒酶阴性肿瘤细胞的生长62
• 1.3 敲低GAB将MCF-7 细胞周期阻滞于G1/S期62-63
• 2 GAB与DNA损伤63-65
• 2.1 长期敲低GAB引起ATM 1981位与H2AX磷酸化63-64
• 2.2 长期稳定敲低GAB引起 53BP1在DNA损伤处聚集,并引起Chk1345位与Chk268位氨基酸磷酸化64-65
• 3 GAB与细胞衰老65-71
• 3.1 长期敲低GAB引起MCF-7 细胞发生衰老65-67
• 3.2 长期敲低GAB可以诱导衰老相关异染色质的形成67-68
• 3.3 长期敲低GAB所引发的衰老细胞与DNA损伤的细胞相同68
• 3.4 GAB调控细胞复制性衰老68-69
• 3.5 GAB不定位到端粒69
• 3.6 敲低GAB后，，hTERT定位到端粒的数量减少69-71
• 第二部分 GAB调节细胞复制性衰老的机制71-108
• 1 GAB与hTERT的相互作用及定位71-75
• 1.1 GAB与hTERT发生相互作用71
• 1.2 GAB、hTERT及其相关突变体蛋白的纯化71-72
• 1.3 GAB与hTERT体外直接相互作用及定位72-74
• 1.4 GAB与TERT的相互作用不是由RNA介导的74-75
• 2 GAB与Dyskerin的相互作用75-76
• 2.1 GAB与Dyskerin存在相互作用且此相互作用为RNA介导75-76
• 2.2 GAB与Dyskerin在体外并非直接结合而是需要hTR介导76
• 3 GAB与hTR的相互作用及其定位76-84
• 3.1 GAB与hTR相互作用的在线预测76-78
• 3.2 GAB与hTR存在相互作用78-79
• 3.3 GAB与hTR相互作用的定位79
• 3.4 GAB与hTR在体外存在直接相互作用79-80
• 3.5 GAB与hTR在体外直接相互作用的定位80-82
• 3.6 RNA-EMSA进一步确认GAB与hTR在体外直接相互作用定位82-84
• 4 GAB调节端粒酶活性84-96
• 4.1 MCF-7、MEF、HT1080端粒酶活性的比较84-85
• 4.2 敲低GAB降低HT1080细胞的端粒酶活性85
• 4.3 GAB调控端粒酶活性的主要结构域85-92
• 4.4 GAB-IP复合体具有较高的端粒酶活性92
• 4.5 GAB的含量对端粒酶活性的影响92-93
• 4.6 GAB调控端粒酶活性不依赖于Pinx193-94
• 4.7 动物实验证明GAB调控端粒酶活性94-96
• 5 GAB调节端粒酶活性的具体分子机制96-107
• 5.1 GAB不改变hTR的表达水平96-97
• 5.2 GAB不改变Dyskerin与hTERT的表达水平97-98
• 5.3 GAB调节hTERT与hTR结合及调节二者结合的主要结构域98-100
• 5.4 GAB对hTERT与Dyskerin、hTERT与TCAB1结合的影响100-101
• 5.5 敲低GAB抑制Dyskerin与hTR的结合101-102
• 5.6 GAB、TCAB1与hTERT细胞内定位的研究102-105
• 5.7 GAB调控端粒酶与Pontin、Reptin无关105-107
• 6 组织中端粒酶活性与GAB表达的初步探索107-108
• 第三部分 p53在GAB调控端粒酶过程中的初步探索108-114
• 1 p53、GAB与端粒酶活性108-111
• 1.1 p53促进ZR75-1 细胞的端粒酶活性108
• 1.2 GAB调节端粒酶活性部分依赖于p53而发挥作用108-110
• 1.3 HCT116细胞中GAB调节端粒酶活性依赖于p53110-111
• 2 GAB与p53存在直接相互作用111-112
• 2.1 GAB与p53存在相互作用111
• 2.2 GAB与p53存在直接相互作用111-112
• 3 敲低GAB在HCT116 p53~(+/+)细胞中抑制hTERT与hTR的结合112-114
• 讨论114-117
• 结论117-118
• 参考文献118-122
• 个人简历122-123
• 攻读硕士学位期间发表文章情况123-124
• 致谢124-125

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1 营孙阳;GAB调控端粒酶组装及肿瘤细胞衰老的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

本文编号：1119360