慢病毒介导恒河猴P53和P21基因沉默的初步研究

发布时间：2017-11-05 22:04

  本文关键词：慢病毒介导恒河猴P53和P21基因沉默的初步研究

  更多相关文章： 恒河猴 P53 P21 慢病毒 基因沉默

【摘要】：背景肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病。作为动物模型,非人灵长类动物与人类的亲缘关系最近,在遗传学和生理学上与人类最相似。建立肿瘤的非人灵长类动物模型可以更利于肿瘤发病机理及治疗方案的研究。P53基因和P21基因是十分重要的抑癌基因,可诱导细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞、有助于DNA修复。下调这两个基因的表达在肿瘤的发病机制中起到重要的作用。目的为了实现非人灵长类动物肿瘤模型,人们期望对动物的肿瘤相关基因进行调控,降低动物P53和P21基因的表达以促进动物肿瘤的发生与发展。本文旨在应用RNA干扰技术对恒河猴P53和P21基因进行沉默调控,以期将之应用于恒河猴肿瘤模型的建立。方法 (1)慢病毒介导的恒河猴P53和P21基因沉默载体的构建及在细胞水平的验证：测定载体细胞COS-7中P53和P21基因的表达水平,对恒河猴P53和P21基因做生物信息学分析,优选靶序列设计shRNA,利用慢病毒质粒FUGW-TDT构建shRNA表达载体,转染COS-7细胞,以Real-time PCR检测P53和P21mRNA表达水平,以Western blot检测P53和P21蛋白水平表达变化。(2)恒河猴P53和P21基因沉默载体包装及在胚胎水平的验证：挑选3个COS-7水平沉默效率较高的慢病毒载体进行包装浓缩纯化,测定病毒滴度。对恒河猴进行超数排卵2次。每次挑选10个MⅡ期卵细胞进行单精子卵胞质注射,其中8个进行卵周隙慢病毒注射,每个慢病毒注射4个受精卵,另外两个未做病毒感染,即空白对照。体外培养120 h,待胚胎发育至桑葚胚时观察荧光。结果(1)慢病毒介导的恒河猴P53和P21基因沉默载体构建成功并在细胞水平验证有效：COS-7细胞P53和P21基因表达水平较高,可以用于基因沉默效率检测；筛选到P53的3个靶位点,分别位于P53 mRNA的238-258 bp,681-701 bp,169-189 bp,均在开放阅读框内。mRNA水平沉默效率为(87.17±4.03)%,(72.62±4.11)%,(76.22±0.98)%,蛋白水平沉默效率为(84.44+2.18)%,(71.04±1.18)%,(74.17±0.95)%；筛选到P21的四个靶位点,分别位于P21 mRNA的541-561bp、542-562bp、 215-239bp、624-648bp,均在开放阅读框内。mRNA水平沉默效率为(91.82±3.21)%、(82.47±2.48)%、(81.31±2.69)%和(87.354±4.59)%,蛋白水平沉默效率为(88.03±0.53)%、(79.78±0.42)%、(76.79±0.63)%和(85.58±0.61)%。(2)恒河猴P53和P21基因沉默载体包装滴度达到要求并在注射胚胎后可见红色荧光：本实验包装病毒后得到滴度分别为2.51 × 109 IU/ml,1.76×109 IU/ml和1.06×l09IU/ml,均大于1×109 IU/ml,满足胚胎感染的要求。在卵周隙注射慢病毒120h后,待胚胎发育到桑葚胚时均可见红色荧光,而未注射病毒的对照组无荧光。结论本实验筛选得到有效的恒河猴P53和P21shRNA慢病毒表达载体,完成了细胞水平的基因沉默效率验证。包装的高滴度慢病毒注射恒河猴胚胎后在桑葚胚期可见红色荧光,实现了胚胎水平的初步验证。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

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本文编号：1146053