Oct4自噬性降解促进肿瘤干细胞分化的分子机制

发布时间：2017-11-06 06:10

  本文关键词：Oct4自噬性降解促进肿瘤干细胞分化的分子机制

  更多相关文章： Oct4蛋白 CMA自噬 ERK 肿瘤干细胞分化

【摘要】：研究背景:Oct4是POU转录因子家族中的一员,主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中,对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用,而且Oct4在重编程和维持干细胞“干性”中起到重要作用。已有研究报道称,在胚胎干细胞中Oct4可经泛素-蛋白酶体途径降解,其中,WWP2(E3泛素蛋白连接酶)可促进Oct4泛素化降解。然而,一些报道称自噬可以调控“干性”相关蛋白(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的稳态变化,进而调控胚胎干细胞的多能性,其中包括Oct4的自噬性降解过程,但其作用机制并没有被阐释。因此,关于Oct4蛋白在如何条件下如何被降解仍未定论。自噬(Autophagy)是一种依赖溶酶体的胞内物质降解过程,目前发现其降解对象囊括了从可溶蛋白到完整细胞器在内的所有胞内物质,其中也包括线粒体。自噬可分为小自噬(Microautophagy)、大自噬(Macroautophagy)以及分子伴侣介导自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA),其中CMA途径可通过Hsp70/Hsc70识别KFERQ样序列的蛋白质并通过溶酶体途径选择性降解底物蛋白,而Oct4是否可被CMA途径降解未曾报道。多项研究报道称,Oct4蛋白可以被AKT、ERK激酶磷酸化进而调控干细胞的多能性,并能提高细胞自我更新的能力,证明Oct4蛋白存在表观遗传学修饰,因此,Oct4经磷酸化修饰后进入自噬降解途径存在理论依据。前期预实验中,我们发现利用荧光激活细胞分选技术分选的鼻咽癌肿瘤干细胞样SP(Side population,SP)样细胞中Oct4蛋白的表达显著高于n SP(No side population,n SP)样细胞,由于SP细胞群属于低分化细胞而n SP细胞属于高分化细胞群,提示Oct4蛋白的质量调控在肿瘤干细胞分化中起到重要作用。由此,自噬如果可以调控Oct4蛋白的降解,进而也可以影响肿瘤干细胞的分化。目的:研究Oct4蛋白能否通过CMA发生自噬性降解,并探究Oct4蛋白翻译后修饰与CMA选择性降解的分子机制,同时初步探究CMA靶向Oct4蛋白与肿瘤干细胞分化的调控关系。方法:采用荧光激活细胞分选技术(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)分选并检测了鼻咽癌CEN-2-S18细胞中SP(Side population,SP)细胞和n SP(No side population,n SP)细胞,通过Western blot检测了干细胞“干性”Marker蛋白Oct4的表达水平;q PCR法检测Oct4蛋白的m RNA水平的变化;si RNA干扰技术敲低LAMP2A、Hsc70和ERK表达后,检测Oct4蛋白的蓄积变化。使用核质蛋白分离和提取技术检测Oct4蛋白在细胞中的分布和量的变化;CHX(Cycloheximide)实验检测Oct4蛋白的稳定性;使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验检测Oct4蛋白与Hsc70的相互作用;免疫荧光(Immunofluorescence)观察Oct4蛋白与溶酶体和Hsc70的共定位;Vector NTI软件对Oct4蛋白氨基酸和晶体结构进行生物信息学分析;定点突变实验检测WT-Oct4-SQ和MT-Oct4-AA分别与Hsc70的相互作用。研究结果:1.Oct4蛋白在CNE-2-S18肿瘤干细胞样SP细胞群中高表达。在鼻咽癌CNE-2-S18细胞中,含有高比例的肿瘤干细胞样SP细胞,同时,我们发现SP细胞中的Oct4蛋白量显著高于n SP细胞,提示CNE-2-S18中含有大量的鼻咽癌肿瘤干细胞。2.Oct4蛋白通过阻断溶酶降解体途径而显著蓄积。使用溶酶体阻断剂(Baf A1、Leu、CQ)、大自噬起始阶段阻断剂(3-MA)和泛素-蛋白酶体阻断剂(MG132)分别处理CNE-2-S18细胞12h、6h和12h发现,Oct4蛋白在细胞内的蓄积依赖于溶酶体降解途径,而且这种蓄积在其他肿瘤细胞中也存在,同时q PCR检测Oct4蛋白的m RNA水平并没有增加。在细胞中的蓄积并不依赖其m RNA水平的增加。3.Oct4蛋白蓄积依赖于CMA自噬流阻断由于前期实验发现大自噬起始抑制剂3-MA并不能引起Oct4蛋白的显著蓄积,所以我们推测Oct4蛋白蓄积很可能是通过另外一条选择性自噬—CMA。于是,我们敲低CMA自噬关键蛋白LAMP2A和Hsc70发现,确实显著提高Oct4蛋白蓄积,而且长期饥饿诱导条件下再去阻断CMA自噬流会使得Oct4显著蓄积。同时,也发现这种现象也存在其他肿瘤细胞中,提示依赖于CMA自噬流阻断的Oct4蛋白蓄积可能在恶性肿瘤细胞中是一种普遍现象。4.Oct4蛋白发生核质转位并与Hsc70相互作用进入CMA途径因为Oct4蛋白发挥生物功能的场所是细胞核,所以我们猜测Oct4蛋白要经CMA降解必然会发生核质转位。通过核质蛋白的分离和提取实验发现,细胞核中的Oct4有所降低,而细胞质中的Oct4则出现显著蓄积。同时,CHX实验发现,长时间饥饿会增加Oct4蛋白的不稳定性,而这种不稳定性很可能是因为Oct4蛋白发生CMA自噬性降解。5.Oct4蛋白中KVFSQ基序是CMA潜在靶向序列通过对Oct4蛋白生物信息学分析发现,Oct4蛋白存在潜在的KFERQ样基序,这段五肽基序KVFSQ在不同物种和POU蛋白家族中存在相对保守性,尤其FSQ连续氨基酸序列。Oct4蛋白晶体带状模型中,潜在五肽基序KVFSQ位于α螺旋和β折叠之间,这种构象更容易发生空间转动来改变其高级结构构象。同样,在球状模型中,Oct4蛋白在执行其基本转录功能时潜在五肽基序KVFSQ位于空间整体的内部。同时,软件预测发现,Oct4蛋白中Ser180可以磷酸化模拟KFERQ样基序。6.ERK介导Oct4蛋白CMA自噬性降解通过定点突变技术构建KVFSQ基序的野生型(WT)和KVFAA基序的突变型(MT)Oct4质粒,将两种质粒分别转入CNE-2-S18细胞中发现,突变型Oct4蛋白不能拉出Hsc70蛋白,这一结果有力证明KVFSQ确实是Hsc70识别的基序,即CMA的靶向序列。激酶抑制剂筛选和siRNA干扰试验发现,ERK介导了Oct4蛋白CMA自噬性降解。7.Oct4蛋白经CMA途径降解来调控肿瘤干细胞分化通过分析CNE-2-S18中SP细胞和n SP细胞的比例,我们发现饥饿诱导的CMA可以促进SP细胞向n SP细胞转化,而阻断CMA自噬流后则促进n SP细胞向SP细胞的转化,即CMA可以促进肿瘤干细胞的分化,而因为维持干性的关键蛋白Oct4是通过CMA途径降解的,所以我们推测Oct4蛋白是通过CMA对其量的控制来调控肿瘤干细胞分化。结论:1.Oct4在长期饥饿条件下可通过CMA(分子伴侣介导自噬)途径被降解,该过程可对Oct4进行质量调控。2.ERK介导Oct4蛋白CMA降解并通过磷酸化KVFSQ基序,然后被Hsc70所识别而形成Oct4-Hsc70复合物被溶酶体膜蛋白LAMP2A识别并通过跨膜转运进入溶酶体降解。3.在肿瘤干细胞分化过程中,CMA通过对Oct4的质量调控而促进肿瘤干细胞分化。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3

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本文编号：1147661