慢病毒介导的RNA干扰RRS1基因对肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响

发布时间：2017-11-06 09:07

  本文关键词：慢病毒介导的RNA干扰RRS1基因对肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响

  更多相关文章： 慢病毒 RNA干扰 RRS1 肝癌 增殖 凋亡

【摘要】：肝癌是世界最常见的恶性肿瘤之一,在世界恶性肿瘤中发病率第五,死亡率第三,其发病率和死亡率逐年增加。肝癌早期临床症状不典型,但病程发展迅速,死亡率极高,使人类的健康受到了极大的挑战。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的基因沉默现象,通过基因工程技术将外源或内源的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)导入目的细胞,能够靶向降解目的基因mRNA,可阻断靶基因的功能表达,进而导致转录后基因沉默。RNA干扰技术的不断进步能够为恶性肿瘤的早期诊断及靶向治疗提供了一种新的方法。近些年来研究发现核糖体的生物合成和活性与肿瘤细胞的发生发展有着密切的关系。核糖体合成调控因子1(Regulator of ribosome synthesis 1,RRS1)是一个具有203个氨基酸的真核生物保守的细胞核蛋白。RRS1可以根据细胞的状态调节核糖体合成的速度,从而保持细胞内的稳态,是蛋白质分泌与核糖体的合成的信号转导途径中的一个重要蛋白质。前期研究证实RRS1蛋白在人肝癌组织的表达较癌旁组织明显增加,但RSS1是否参与肝癌恶性生物学行为的调控及其可能的调控机制尚不明确。本实验通过构建慢病毒介导的RRS1-siRNA表达载体,经基因测序法鉴定后成功转染到人肝癌细胞SMMC-7721,进一步选用Western blot(WB)技术及RT-PCR检测RRS1 mRNA、RSS1表达量的改变,并利用利用Cellomics检测RRS1基因干扰前后SMMC-7721细胞的增殖能力的变化;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测RRS1基因干扰后细胞生长、细胞周期分布及细胞凋亡比例的变化,探讨慢病毒介导的RRS1基因沉默后针对肝癌SMMC-7721细胞中RRS1 mRNA、RSS1蛋白表达水平的变化以及对细胞增长、细胞周期分布、细胞凋亡等生物学行为的影响。实验结果表明:1.成功构建了pGCSIL-GFP-RRS1载体,经基因测序证实插入序列符合设计要求,共转染293T细胞,生产出含有LV-RRS1-shRNA的重组慢病毒,进一步测定其滴度为8x108 TU/mL。2.重组慢病毒感染肝癌细胞株,与Lv-shCon组相比,Lv-shRRS1组SMMC-7721中的RRS1的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,分别下降68%和73%。3.与Lv-shCon组相比,Lv-shRRS1组细胞增殖能力显著降低。4.Lv-shCon组凋亡率为(8.15+0.33)%,明显低于Lv-shRRS1组细胞凋亡率为(36.5+0.19)%(P0.01)。5.与Lv-shCon组相比,Lv-shRRS1组细胞周期分布发生改变,G1期细胞数量显著增多(P0.01),S期及G2/M期细胞数量明显降低,差异具有显著性意义(P0.05)。通过本实验得出以下结论:1.成功构建了靶向RRS1 mRNA的siRNA慢病毒表达载体,构建RRS1 shRNA慢病毒感染SMMC-7721细胞株,经检测可显著地抑制RRS1基因的表达,为进一步深入研究相关机制奠定了实验基础。2.靶向抑制肝癌细胞RRS1基因表达后,使细胞周期阻滞在G1期,明显降低细胞增殖速率,并促进细胞凋亡发生,这提示RRS1参与调控肝细胞癌增殖活性、细胞周期以及凋亡能力,为肝癌患者的基因靶向治疗提供理论基础,并为进一步研究RRS1基因在肝癌发生、进展、侵袭中的功能提供了一定的实验依据。
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨爱清;贺福初;周钢桥;;核糖体合成调控蛋白RRS1的功能及其与疾病的关系[J];生物技术通讯;2014年06期

，

本文编号：1148235