姜黄素通过抑制NF-κB通路逆转吸烟诱导膀胱上皮细胞上皮间质转化

发布时间：2017-11-11 17:43

  本文关键词：姜黄素通过抑制NF-κB通路逆转吸烟诱导膀胱上皮细胞上皮间质转化

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【摘要】：背景与研究目的膀胱癌是世界上发病率较高的泌尿系统恶性肿瘤之一,其中最常见的病理类型是移行上皮细胞癌,具有复发性,浸润性和难治愈性等特点。流行病学研究已经证实香烟暴露是膀胱癌的重要诱发因素之一,但香烟暴露与膀肿癌进展的分子机制尚未得到充分研究。研究显示上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤细胞的进展中起到至关重要的作用。大量研究证实姜黄素对多种肿瘤细胞的生长均有抑制作用。实验着重研究香烟暴露对膀胱移行上皮细胞EMT的影响,并探讨NF-κB通路在EMT中的作用及姜黄素的干预效应。方法首先通过MTT实验筛选出对膀胱正常上皮细胞(SV-HUC-1 cells)没有毒性的香烟悬液(cigarette smoking extract,CSE)浓度。(1)观察CSE处理对SV-HUC-1细胞形态的影响,使用显微镜进行拍照并记录。(2)利用细胞划痕实验和transwell小室实验观察CSE处理对细胞的迁移和侵袭能力的变化,并用显微镜拍摄记录。(3)CSE处理后,观察细胞的上皮间质转化标志物蛋白及m RNA水平的变化,采用Western Blotting和q RT-PCR及免疫荧光的方法检测。(4)接着应用Western Blotting检测了CSE处理后细胞内NF-κB通路标志性蛋白的变化。(5)继而用NF-κB通路特异性抑制剂观察其对CSE诱导的SV-HUC-1细胞上皮间质转化作用的逆转效果。(6)最后将CSE和姜黄素联合处理细胞,观察姜黄素对CSE引起的SV-HUC-1细胞上皮间质转化的逆转作用。结果(1)通过MTT检测不同香烟悬液浓度下的细胞活性,我们发现1%时细胞活性下降至80%以下,存在统计学意义。最终选择香烟悬液的浓度为选用0.1%,0.25%,0.5%做为实验剂量。(2)将SV-HUC-1细胞暴露于选定的香烟悬液下7天后,观察细胞形态,发现正常的膀胱移行上皮细胞呈现饱满的圆形,椭圆形,细胞呈凝聚状态。处理后细胞变成长梭形,形似蝌蚪状,细胞之间较为分散。细胞划痕实验及transwell小室实验证明细胞的迁移及侵袭能力升高。(3)经香烟悬液处理7天后,Western Blotting,q RT-PCR及免疫荧光检测细胞的标志物。发现上皮标志物:E-Cadherin、ZO-1表达下降,间质标志物:vimentin、N-cadherin表达上调。(4)NF-κB通路激活,一定香烟悬液浓度下,随着香烟悬液浓度增加,NF-κB特异性蛋白:p65,p50的核表达水平升高,胞质中的磷酸化IKKα/β(phosphorylated IKKα/β)升高,而通路的抑制剂IκB持续降低。通过蛋白检测证实当NF-κB通路活性被抑制剂PDTC有效抑制时,香烟悬液诱导的SV-HUC-1细胞上皮间质化被成功逆转。上皮标志物:E-Cadherin、ZO-1表达上调,间质标志物:vimentin、N-cadherin的表达下调。细胞形态及细胞的迁移侵袭能力被抑制。(5)姜黄素通过抑制NF-κB通路活性,达到抑制香烟悬液诱导的上皮间质转化作用的效果。通过蛋白及基因检测,发现上皮蛋白表达水平上调,间质蛋白表达水平下降。结论1、香烟悬液诱导膀胱移行上皮细胞发生上皮间质转化。2、NF-κB通路在香烟悬液引起的上皮间质转化中起到重要的作用,为流行病学调查起到相互印证的作用,同时为分子靶向治疗提供科学依据。3、姜黄素对膀胱癌的发生发展有一定的干预治疗效果,且为膀胱癌的分子治疗提供了新的方向及治疗后的预防提供了新的方法。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14

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