苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1与PS4蛋白结构的比较与抗癌谱筛选

发布时间：2017-11-12 12:05

  本文关键词：苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1与PS4蛋白结构的比较与抗癌谱筛选

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【摘要】：目的:①比较苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry51Aa1蛋白与具有毒杀癌细胞活性的Parasporin蛋白之间的进化关系及结构异同,由结构相似性推测目的蛋白Cry51Aa1蛋白可能具有的抗癌活性;②测试Cry51Aa1蛋白的抗癌活性及抗癌谱,筛选出1-2种敏感细胞株,并初步探讨Cry51Aa1对靶癌细胞发挥毒性作用的机制,为研究Cry51Aa1的功能提供新的生物学证据。方法:①采用生物信息学在线数据库分析Cry51Aa1的理化性质并调取其氨基酸序列信息,同时调取已报道的6类19种抗癌Parasporin蛋白序列,应用最大似然聚类法建立Cry51Aa1与PS家族的系统进化树图,找出可能与Cry51Aa1同源的PS蛋白;针对与Cry51Aa1序列相似度最高的PS蛋白,进一步比较两者在一级和二级结构中的各项参数,并以SWISS-MODEL进行同源建模,比较两者的三级空间结构,全面分析两者结构的异同。②纯化Cry51Aa1蛋白后,以18种细胞(包括12种人类肿瘤细胞,2种人类正常细胞,1种鼠肿瘤细胞,3种鼠正常细胞)作为受试对象,利用MTT实验初步筛选Cry51Aa1对各类细胞的细胞毒性作用,对敏感细胞株进一步分析时间和浓度因素对细胞生存率/抑制率的影响;③以流式细胞术(FCM)和免疫印迹实验(WB)探讨Cry51Aa1是否通过诱导细胞凋亡的方式发挥细胞毒性作用。结果:①通过氨基酸序列聚类建立的系统进化树图中,Cry51Aa1与PS4的氨基酸序列相似度最高,达到36%,自引导评估得boostrap值(自展值)70,认为可信度较好。从结构比较中进一步体现了两者的结构相似性,两种蛋白模型在α-碳原子(Carboon alpha,CA)部分的结构差异均方根(RMS)=0.92。②Cry51Aa1易引起敏感靶细胞发生肿胀等形态学改变,细胞形态改变的程度与浓度梯度呈现一致性变化,随着作用时间的增加,肿胀的比例减少;③不同的细胞对Cry51Aa1的敏感性存在差异,肿瘤细胞敏感性高于正常细胞,且不同肿瘤系统的细胞对Cry51Aa1的敏感性存在差异,筛选到的Cry51Aa1抗癌谱包括消化系统的SGC-7901、GBC-SD与RBE,生殖系统的Hela、HEC、HBL-100、MDA-MB-231;④较高浓度的Cry51Aa1引起细胞发生凋亡,且初步认为,Caspase家族在Cry51Aa1引起的细胞凋亡中可能发挥了重要作用。结论:①Cry51Aa1蛋白可能与抗癌PS蛋白同源,且与PS4在氨基酸序列上亲缘关系最近,两者的结构相似性较高;②Cry51Aa1蛋白对多种人类肿瘤细胞具有细胞毒性,且敏感性存在差异。本次筛选到的抗癌谱包括消化系统3个细胞株和生殖系统4个细胞株,胃癌SGC-7901表现最为明显和稳定,但Cry51Aa1的特异性毒性还需经更大范围的抗癌谱验证;③Cry51Aa1引起细胞发生形态学和细胞活力的改变,且即细胞抑制率与蛋白浓度成存在剂量-反应关系,正比;④Cry51Aa1发挥细胞毒性可能是Caspase介导的细胞凋亡,且对细胞的迁移能力发挥一定的抑制作用。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

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本文编号：1175810