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GPER介导他莫昔芬对人乳腺癌相关成纤维细胞的增殖、迁移及凋亡作用

发布时间:2017-11-12 21:26

  本文关键词:GPER介导他莫昔芬对人乳腺癌相关成纤维细胞的增殖、迁移及凋亡作用


  更多相关文章: G蛋白偶联雌激素受体(GPER) 慢病毒 人乳腺癌相关成纤维细胞(CAF) 他莫昔芬


【摘要】:目的:通过构建G蛋白偶联雌激素受体(GPER)的慢病毒短发夹RNA(shRNA)表达载体,探讨GPER介导他莫昔芬(tamoxifen, TAM)对人乳腺癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast, CAF)的细胞增殖、迁移与凋亡作用1。方法:1.设计4条长度为19 bp的针对GPER基因shRNA的寡核苷酸序列及阴性对照序列,合成相应的siRNA序列。将GV1 15载体用AgeⅠ和EcoR I行双酶切,将酶切产物和合成的成对的寡链氨基酸退火形成双链DNA结构混合,通过T4 DNA连接酶连接,用大肠杆菌感受态细胞转化后挑取转化子,使用GV115载体通用引物,进行菌落PCR及测序鉴定,在HEK293T细胞中包装病毒及测定病毒滴度。通过实时定量PCR进行内源性筛靶,选取干扰效果最佳的病毒进行后续实验,Western blot法检测慢病毒在靶细胞的蛋白表达。2.将CAF细胞分为4组,NC(negative control,NC)组、GPER-RNAi、NC联合TAM组和GPER-RNAi联合TAM组,CCK-8检测法、流式细胞术及Transwell实验检测经他莫昔芬处理后各组CAF细胞的增殖、迁移及凋亡能力。结果:1.Lenti-GPER-siRNA慢病毒载体经HEK293T细胞包装成功,Western blot结果显示转入病毒后GPER在CAF细胞中的表达较NC组显著降低(P0.05)。2.流式细胞术及CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。各组PI分别为(30.76±7.4)%,(32.54±3.5)%,(43.61±4.4)%(P=0),(34.93±6.8)%。TAM处理72h后,NC联合TAM组细胞数增加至NC组的(172.16±10.8)%(P=0)。GPER-RNAi组细胞数为NC组的(92.73±7.1%(P=0.10),GPER-RNAi联合TAM组(96.58±4.2)%(P=0.43)。流式细胞术检测NC组、GPER-RNAi组、NC联合TAM组和GPER-RNAi联合NC组细胞凋亡比率分别为:(29.10±1.4)%、(28.27±1.3)%、(9.62±0.91)%、(31.09±1.2)%。GPER-RNAi组细胞凋亡比率与NC组无明显差异P0.05,。NC联合TAM组凋亡低于对照组(P0.05)。Transwell实验提示加入TAM后,CAF迁移细胞数明显增加(迁移细胞数由40.75±3.59个增加至99.50±4.80个),而GPER-RNAi联合TAM组则无明显变化。结论成功构建Lenti-GPER-siRNA慢病毒载体,感染CAF后可有效沉默GPER表达;TAM通过GPER促进CAF细胞增殖并抑制其细胞凋亡。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R737.9

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本文编号:1177707

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