ROS在白藜芦醇诱导人结肠癌HCT116细胞自噬中的作用

发布时间：2017-11-13 05:31

  本文关键词：ROS在白藜芦醇诱导人结肠癌HCT116细胞自噬中的作用

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【摘要】：目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,RSV)诱导人结肠癌细胞HCT116自噬过程中,ROS发挥的作用。同时研究RSV诱导细胞自噬过程中ROS、p53、NQO1等的相关性及其相互调节,以了解ROS在RSV诱导结肠癌细胞自噬中的调节机制,从而为白藜芦醇治疗结肠癌的研究提供充分可靠的理论支持。方法:1用DMEM/F12培养基培养人结肠癌HCT116细胞,待其生长至培养皿的80%左右时,应用ROS清除剂(NAC)预先对其进行处理1h,再用不同剂量的白藜芦醇处理细胞24h后,用倒置显微镜观察细胞的形态和数量的变化。其中培养基含有10%的澳洲胎牛血清。2运用MTT法检测药物处理细胞后的生存率的改变。同时运用NBB法检测NAC与白藜芦醇共同处理组和只加白藜芦醇组细胞生存率变化的比较。3应用单丹磺酰戊二胺(MDC)法检测药物处理细胞后的酸性自噬泡的变化。4应用DAPI染色法检测不同药物处理细胞后的细胞核和染色质的变化。5不同药物处理HCT116细胞和SIRNA技术沉默p53后,Western blot法检测后,自噬相关蛋白以及p53,NQO1,Nrf2等蛋白的表达情况。6流式细胞术法检测不同剂量的白藜芦醇和双香豆素作用细胞24h后的ROS变化趋势。7应用SPSS13.0处理实验过程中的多次重复和对照的结果,且均采用t检验的方法分析,最后的实验结果会以均数±标准差的形式表示,如果P0.05则说明具有统计学意义。结果:1首先用不同剂量药物(0-200μM)作用于HCT116细胞后,MTT的结果显示细胞的存活率会随着药物浓度的升高而减低。此外,在显微镜下观察发现,不同剂量的药物(0-150μM)处理HCT116细胞24h后,随着药物剂量的增加,细胞也会随之发生变化。主要表现为镜下细胞的触角逐渐减少,相互之间的空隙增大,数目越来越少。同样,100μM白藜芦醇作用于人结肠癌细胞HCT116不同的时间(0,12,24,48h)后,细胞形态和数量的改变与浓度组的改变趋势基本相同。2应用DAPI法和Western Blot法检测浓度组和时间组的细胞后,发现细胞并没有明显的凋亡现象。经过MDC试剂染色发现,不同剂量的白藜芦醇作用于HCT116后,随着白藜芦醇剂量的增加,自噬泡的数量也会随之增多。同时运用Western Blot法对自噬相关蛋白Beclin-1和LC3进行了检测,结果发现二者的表达均随着药物剂量的增加而升高,同时抗凋亡有关的蛋白bcl-2和凋亡有关的Bax也是呈升高趋势,且bcl-2/Bax的比值在一定范围内也是有升高趋势的。此外,应用白藜芦醇处理HCT116不同时间(0,12,24,48h)后,发现细胞自噬现象与不同剂量组的自噬现象基本相同。这些结果都提示了HCT116细胞内有自噬现象的出现。3流式细胞术检测细胞内ROS的含量,结果发现不同剂量的白藜芦醇作用于HCT116后,随着药物剂量的增加,ROS的总体含量也会随之升高。4经过NBB法检测显示,白藜芦醇与NAC共同处理细胞组和白藜芦醇组的细胞都会受到白藜芦醇剂量的影响,细胞生存率均下降,但是两种药物共同处理组的生存率会高于白藜芦醇组的细胞生存率。倒置显微镜观察显示,两种药物共同处理组的细胞存活数多于白藜芦醇组的细胞数。5经过MDC试剂染色发现,白藜芦醇与NAC共同处理细胞后,自噬泡数量比白藜芦醇组的自噬泡数量要少。Western Blot法检测,发现白藜芦醇与NAC共同处理细胞后,各个蛋白的表达量均会低于白藜芦醇组的表达量。6经过Western Blot法观察,ROS清除剂(NAC)、p53激动剂(Nutlin-3)、抑制剂(PFT-α)和NQO1活性抑制剂(双香豆素)分别和白藜芦醇一起处理HCT116后,NAC、PFT-α和双香豆素组的蛋白表达量显著低于白藜芦醇组蛋白的表达量,Nutlin-3组的蛋白表达量会高于白藜芦醇组的蛋白表达量,双香豆素组的LC3和Beclin-1蛋白表达量明显高于白藜芦醇组蛋白的表达量。结论:1白藜芦醇能够明显的抑制体外培养的HCT116的生长,并且这种抑制作用与药物的剂量和作用时间有明显的关联。2白藜芦醇能够在一定浓度和时间范围内诱导HCT116自噬的发生,并且ROS在其中发挥了一定作用。3 NQO1、Nrf2等氧化应激相关蛋白可以与p53相互调节影响细胞内的ROS水平,来影响细胞自噬,同时细胞的氧化应激状态可以通过影响p53来调控细胞自噬。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

【共引文献】

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本文编号：1179320