PPFIA1在慢性粒细胞白血病（CML）的功能及其相关磷酸化信号分子和相互作用蛋白的鉴定研究

发布时间：2017-11-15 16:27

  本文关键词：PPFIA1在慢性粒细胞白血病（CML）的功能及其相关磷酸化信号分子和相互作用蛋白的鉴定研究

  更多相关文章： PPFIA1 慢性粒细胞白血病 c-KIT PARP1 BCR-ABL 免疫沉淀 免疫共沉淀

【摘要】：研究背景:前期通过基因芯片技术和生物信息学相结合的方法研究发现miR-181a在慢性粒细胞白血病(CML)中有多个靶基因,经实验验证PPFIA1受miR-181a的直接调控,初步鉴定PPFIA1具有癌基因功能,但PPFIA1在CML中确切的分子作用机制尚不清楚。研究目的:本课题致力于探索PPFIA1对CML恶性进展的影响及其下游磷酸化信号分子和相互作用的蛋白鉴定,为白血病分子靶向治疗提供新的实验依据。研究方法:1.利用PPFIA1慢病毒颗粒构建稳定过表达PPFIA1蛋白的K562细胞;Western Blot验证K562细胞内PPFIA1表达水平;2.脂质体Lipofectamine TM 3000转染PPFIA-siRNA到K562细胞;3.Biotool Vita-Blue试剂检测PPFIA1对K562细胞药物敏感性的影响;4.甲基纤维素集落形成法检测PPFIA1对K562细胞增殖能力的影响;5.Transwell小室法检测PPFIA1对K562细胞侵袭能力的影响;6.磷酸化抗体芯片检测靶向抑制PPFIA1后K562细胞相应磷酸化蛋白表达水平的改变,并在K562和KCL-22细胞中使用Western Blot验证相关信号分子的改变;7.利用flag-PPFIA1慢病毒颗粒构建稳定表达flag-PPFIA1融合蛋白的K562细胞株,flag-BCR/ABL和myc-PARP1质粒构建稳定表达flag-BCR/ABL的293T细胞株;8.免疫沉淀(IP)flag-PPFIA1和flag-BCR/ABL融合蛋白,利用蛋白质质谱技术鉴定两组ip产物中的蛋白质组成。9.discoverystudio4.5client软件进行蛋白质结构的空间模拟对接,分别预测与ppfia1及bcr/abl蛋白直接作用的特异性蛋白,对免疫沉淀产物中的特异性蛋白质分子进行westernblot实验验证。10.parp1抑制剂olaparib处理k562-lentivppfia1后cck8检测药物敏感性及细胞克隆形成能力的变化。研究结果:1.westernblot检测病毒感染后k562-ppfia1lentiv比k562-emptylentiv细胞内的ppfia1蛋白表达水平明显升高;2.过表达ppfia1基因后降低了k562细胞对imatinib和dasatinib的药物敏感性,增强了k562细胞的colony形成和侵袭能力;3.靶向抑制ppfia1增强了k562细胞对imatinib的药物敏感性,减弱了k562细胞的colony形成和侵袭能力;4.磷酸化芯片显示,靶向抑制ppfia1蛋白磷酸化水平下降率高于20%的蛋白有28种。其中c-kit(tyr721)磷酸化水平下降最明显,达76%,westernblot结果显示ppfia1能激活c-kit、akt、erk1/2磷酸化信号通路,靶向抑制ppfia1可以降低其磷酸化信号水平。5.质谱鉴定flag-bcr/abl免疫沉淀产物有132种特异性蛋白,而flag-ppfia1免疫沉淀产物有42种,其中parp1和ncoa5是flag-ppfia1和flag-bcr/abl两个免疫沉淀产物中共同存在的蛋白质分子。6.空间模拟对接和免疫共沉淀(co-ip)结果显示ppfia1能和parp1相互直接结合。7.parp1抑制剂olaparib能显著减弱k562-lentivppfia1细胞的活力和colony形成能力。8.过表达ppfia1可以激活parp1/p65/c-kit的磷酸化表达水平,靶向抑制ppfia1和parp1均可抑制p65和c-kit的磷酸化表达水平。研究结论:1.PPFIA1在CML中具有癌基因功能,靶向抑制PPFIA1基因的表达可以抑制CML恶性进展。2.PPFIA1下游涉及C-KIT等28个磷酸化信号分子。3.PPFIA1能与PARP1蛋白结合,促进P65转录进而激活C-KIT磷酸化信号通路,增强CML恶性进展。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 庄祥云;干扰素对慢性髓细胞性白血病(CML)的治疗[J];日本医学介绍;1985年12期

2 ;慢性粒细胞白血病(CML)的分期标准[J];临床荟萃;1990年07期

3 ;慢性粒细胞白血病(CML)的分期标准[J];实用内科杂志;1990年03期

4 刘利;刘强;陈任安;何华;蒋姗姗;杜娟;梁英民;;7例格列卫联合非清髓造血干细胞移植治疗加速期、急变期CML的临床观察[J];中国肿瘤临床;2006年17期

5 杨文西;;Ph~1阳性慢性粒细胞白血病(CML)的存活:与诊断时的发现和第一疗程后疾病动力学的关系[J];国外医学.输血及血液学分册;1986年04期

6 张守宽,李强;检测和诊断Ph~+CML的一种简单、可靠和敏感的方法——外周血细胞间期荧光原位杂交[J];国外医学.输血及血液学分册;2000年02期

7 刘鸿;某治疗中心16年观察所见430例CML病人初诊时的临床特征[J];国外医学.输血及血液学分册;1997年04期

8 秦春圃;应用FISH评估IFN治疗CML的疗效[J];生物技术通报;2002年06期

9 李雅琴;胡予;;慢性粒细胞白血病(CML)细胞分裂中期9和22号染色体的空间关系[J];国外医学.输血及血液学分册;1989年01期

10 熊玉宁;IL-1β和TNF-α与CML病程进展的关系研究[J];白血病;1999年01期

中国重要会议论文全文数据库 前3条

1 刘利;梁英民;刘强;郝淼旺;陈任安;蒋姗姗;张继良;王黎红;何华;吴绒丽;杜娟;叶盛开;尹单单;韩骅;;格列卫联合非清髓造血干细胞移植治疗加速期、急变期CML的临床研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

2 王琳;徐卫东;;治疗性血液成分去除术在难治性ITP、CML高危组和PV中的临床应用研究[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年

3 顾乐怡;倪兆慧;Yasuhiko Tomino;钱家麒;;NF-κB和Sp1调节CML诱导的足细胞MCP-1基因转录[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 刘娜;氯化两面针碱及Wnt通路受体FZD7在CML中的作用及机制研究[D];山东大学;2015年

2 罗依;CML酪氨酸激酶抑制剂分子靶向药物及异基因造血干细胞移植分层治疗研究[D];浙江大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 马放;基于CML接口的多通道数模混合采存装置的设计与研究[D];中北大学;2016年

2 古春明;PPFIA1在慢性粒细胞白血病（CML）的功能及其相关磷酸化信号分子和相互作用蛋白的鉴定研究[D];暨南大学;2016年

3 伊娜;亲缘间异基因外周血造血干细胞移植治疗CML的临床疗效分析[D];新疆医科大学;2012年

，

本文编号：1190469