曲妥珠单抗—纳米金探针制备及对乳腺癌细胞体外生长抑制作用

发布时间：2017-11-20 22:19

  本文关键词：曲妥珠单抗—纳米金探针制备及对乳腺癌细胞体外生长抑制作用

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【摘要】：目的：构建新型曲妥珠单抗-纳米金生物探针,研究其对乳腺癌细胞的作用,探寻乳腺癌纳米靶向治疗新方法。方法：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备不同尺寸(10nm、20 nm和40 nm)金纳米粒子(GNPs),并行透射电镜(TEM)表征,同时40 nm GNPs还进行紫外可见吸收光谱、水动力尺寸、zeta电位等检测。通过静电吸附原理将40 nm GNPs与曲妥珠单抗(Herceptin)偶联合成曲妥珠单抗-纳米金(Herceptin-GNPs)生物探针,表征方法同40 nmGNPs,并采用BCA蛋白定量法测Herceptin-GNPs中抗体偶联量。人乳腺癌细胞株BT474和MCF-7细胞表皮生长因子受体-2(HER2)表达情况采用免疫细胞化学法检测。采用扫面电子显微镜(SEM)观察BT474细胞膜表面的Herceptin-GNPs吸附作用。分别设置10 nm、20 nm和40 nm GNPs浓度为12.5～100 μg/mL4个浓度,分别设置Herceptin-GNPs和Herceptin浓度为0.625～10 μg/mL 5个浓度,并设置对照组和空白组,作用于BT474和MCF-7细胞48 h,采用MTT法检测各组细胞增殖抑制情况。分别设置Herceptin-GNPs和Herceptin浓度为1.25、2.5、5μg/mL3个浓度,并设置对照组,采用Annexin V-FITC/PI双染、PI单染法行流式细胞术检测BT474细胞凋亡率和周期变化情况,以及采用Western Blot技术分别检测p-AKT、p-MAPK、Bcl-2、HER2蛋白表达情况。结果：(1)柠檬酸还原法制备的不同尺寸GNPs (10 nm、20 nm和40 nm)水溶液呈酒红色,澄清透亮,TEM结果显示GNPs近似圆形,平均粒径大小分别为10.2±1.2 nm、20.9±2.0 nm和40.7±2.2 nm。通过紫外可见吸收光谱、水动力尺寸、zeta电位、TEM检测,证实成功合成Herceptin-GNPs探针,BCA法测得每毫升Herceptin-GNPs探针抗体偶联量为11.3嵋,抗体偶联率约为37.67%,经计算得每个40 nm GNP表面可以连接约633个Herceptin分子。(2)免疫细胞化学方法证明人乳腺癌MCF-7细胞HER2低表达,BT474细胞HER2高表达。在不同尺寸GNPs毒性研究方面,可见10 nm GNPs在50 ng/mL可抑制BT474细胞增殖,而在100ng/mL时可抑制MCF-7细胞增殖,而20nm和40 nm在100 μg/mL及以下浓度时均未对两株细胞显示出明显增殖抑制作用,提示GNPs细胞毒性低。(3)不同浓度Herceptin和Herceptin-GNPs对BT474细胞生长具有剂量依赖的抑制作用,Herceptin-GNPs较单独应用Herceptin抑制作用更强。流式细胞术检测显示Herceptin-GNPs和Herceptin均诱导BT474细胞凋亡,阻滞细胞子G0/G1期,且Herceptin-GNPs作用强于Herceptin。Western Blot结果显示, Herceptin-GNPs和Herceptin均可降低AKT、MAPK蛋白磷酸化水平,下调抑凋亡蛋白Bcl-2表达,诱导细胞凋亡,降低HER2蛋白表达,且Herceptin-GNPs作用强于Herceptin。结论：柠檬酸还原法制备的GNPs细胞毒性低,生物相容性好；Herceptin-GNPs较单独应用Herceptin能显著抑制HER2阳性乳腺癌BT474细胞增殖,抑制下游信号转导,诱导细胞凋亡,增加HER2内吞,在减少Herceptin用药剂量同时疗效增加,为HER2过表达乳腺癌的靶向治疗提供了新的方法。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

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