一碳单位代谢相关维生素与MGMT基因甲基化在食管癌发生中的作用研究

发布时间：2017-11-21 21:33

  本文关键词：一碳单位代谢相关维生素与MGMT基因甲基化在食管癌发生中的作用研究

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【摘要】：目的：在江苏淮安食管癌高发地区开展病例对照研究,探讨06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransf erase, MGMT)基因启动子区甲基化在食管癌发生中的作用及其与叶酸和一碳单位代谢相关B族维生素的交互作用,并通过体外细胞实验观察AFB1对人类食管正常上皮细胞活性、细胞周期和凋亡及MGMT基因启动子区甲基化的影响,同时验证叶酸及相关B族维生素的干预作用,分析相关B族维生素,MGMT基因启动子区甲基化与食管癌及癌前病变之间的关系,提供其与食管癌及癌前病变之间更直接的证据,以期寻找食管癌诊断的有效分子生物学指标,为早诊早治,和食管癌的早期营养学预防提供一定的理论基础和指导。方法：(1)在淮安食管癌高发区按性别、年龄±2岁为条件配对收集食管癌、癌前病变及健康人各220例,收集食管癌患者、食管癌前病变患者和正常对照人群的血液样本,提取DNA,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific pcr,MSP)方法对样本进行甲基化测定(2)采用酶联免疫吸附法检测血清叶酸、VB2、VB6、VB12含量并比较食管癌组、癌前病变组和正常对照组血清叶酸、VB2、VB6、VB12的差异。将三组间差异有显著性的维生素含量按正常对照组四分位数分为四个等级,并将环境及饮食等危险因素暴露频率赋值,采用多项Logistic回归分析不同血清维生素含量水平环境及饮食因素与MGMT基因启动子区甲基化水平之间的交互作用。(3)利用四甲基氮唑蓝(MethylThiazolyl Tetrazolium,MTT)法测定AFB1对人食管正常上皮细胞HEEPiC增殖的影响；流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况；MSP法检测细胞MGMT基因启动子区甲基化的水平。(4)采用叶酸、叶酸+维生素B2、叶酸+维生素B6、叶酸+维生素B12干预AFB1处理的人类正常食管上皮细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况,杂交芯片法定量检测细胞MGMT基因启动子区甲基化的水平。结果：(1)在食管癌组、食管癌前组、正常组人群中,MGMT基因启动子区甲基化率分别为37.3%(82/220)、19.1%(41/220)和3.8%(8/220)。MGMT基因DNA甲基化率在对照组、食管癌前病变组与食管癌组三组间差异有显著性,具有统计学意义(x2=26.90,P0.001)。单因素logistic回归检验结果表明MGMT基因启动子区甲基化是食管癌前病变和食管癌发生的危险因素(ORs=7.58、11.65)(2)血清维生素B2水平、血清维生素B12水平与MGMT基因甲基化对食管癌和癌前病变的发生没有交互作用。血清叶酸水平和MGMT基因甲基化对食管癌和癌前病变的发生存在交互作用(P0.05)。血清叶酸第二四分位与最低四分位比较,可减少MGMT基因启动子区非甲基化者发生食管癌前病变及食管癌的风险(P0.05)。当血清叶酸水平较高时(26.92),可减少MGMT基因甲基化和非甲基化者发生食管癌及食管癌前病变的风险(P0.05)。血清维生素B6水平和MGMT基因甲基化对食管癌和癌前病变的发生存在交互作用(P0.05)。当血清维生素B6水平在最低四分位时MGMT基因甲基化者较非甲基化者发生癌前病变以及患食管癌的风险增加(P0.05)。血清维生素B6最高四分位与最低四分位相比,MGMT基因甲基化与非甲基化者发生食管癌前病变的风险都增加OR值分别为2.024和2.771。食用油白菜、腌制食品与MGMT基因启动子区甲基化对食管癌发生有交互作用。(3)用0.2μg/mL、0.4μg/mL、 0.8μg/mL、1.6μg/mL、2μg/mLAFB,处理人类正常食管上皮细胞24h、48h、72h,均可以抑制细胞增殖。0.8μg/mL、1.6μg/mL、2μg/mL AFB处理48h时,G0/G1期细胞比例明显低于阴性对照组(p0.05); 0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、2μg/mL AFB,处理S期细胞比例明显高于阴性对照组(p0.05),细胞被阻滞在S期；同时1.6μg/mL、2μg/mLAFB处理48h时G2/M期细胞比例明显高于阴性对照组(p0.05),细胞也被阻滞在G2/M期。AFB1分别在0.4μg/mL,0.8μg/mL,1.6μg/mL和2μg/mL的剂量时细胞凋亡比例与阴性对照组比较有显著性差异(p0.05),可促进人类正常食管上皮细胞凋亡。2μg/mL AFB,处理的细胞出现MGMT基因启动子区甲基化,其余各剂量组未出现甲基化。(4)几种B族维生素干预后可改善黄曲霉毒素抑制细胞增殖的现象。经统计学检验,各处理组细胞抑制率明显低于染毒对照组(p0.05)。AFB1处理48h时,染毒对照组G0/G1期细胞比例明显低于正常对照组,S期,G2/M期细胞比例明显高于正常对照组,细胞被阻滞在S期和G2/M期：而几种B族维生素干预后S期细胞比例明显低于染毒对照组；除叶酸+B6组,其他各干预组G2/M期细胞比例明显低于染毒对照组,减少了S期和G2/M期的阻滞。同时几种B族维生素干预组的细胞凋亡比例明显低于染毒对照组,差异具有统计学意义(p0.05)。甲基化定量检测结果显示叶酸及一碳单位代谢相关B族维生素组CpG14-15位点甲基化率明显低于染毒对照组,差异具有统计学意义(p0.01)。结论：食管癌和癌前病变的发生发展与MGMT基因启动子区甲基化有关,并与叶酸等血清B族维生素存在一定交互作用。体外细胞实验结果表明,AFB1能够抑制人正常食管上皮细胞增殖,促进细胞凋亡,促进细胞从G0/G1期进入S期,导致S期和G2/M期阻滞,并导致MGMT基因启动子区发生甲基化。为了进一步研究体外细胞实验中叶酸等B族维生素与MGMT基因启动子区甲基化的交互作用,进行了干预实验,结果表明叶酸等B族维生素能抑制AFB,的抑制细胞增殖作用,明显改善AFB1对细胞周期S期的阻滞,促进细胞进入G2/M期,阻滞AFB1促进人类正常食管上皮细胞凋亡的作用,并减轻MGMT基因启动子区甲基化的程度。体外干预实验结果为进一步研究黄曲霉毒素对人正常食管的作用及机制及叶酸等一碳单位代谢相关B族维生素的保护作用提供了研究基础。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

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本文编号：1212331