慢性淋巴细胞白血病自噬相关基因的表达及西达本胺的作用

发布时间：2017-11-27 19:32

  本文关键词：慢性淋巴细胞白血病自噬相关基因的表达及西达本胺的作用

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【摘要】：目的：BECN1及ATG5基因在细胞自噬中起重要的调节作用。本研究探讨BECN1及ATG5基因在慢性淋巴细胞白血病(CLL)的表达及其临床意义。方法：收集100例初诊或6个月未治疗的CLL患者和50例健康正常人标本,采用SYBR Green荧光染料实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测两组BECN1及ATG5 mRNA表达水平,运用循环阈值(Ct)比较法进行分析。采用PCR以及DNA序列测定CLL患者p53和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变；流式细胞术(FCM)检测CD38及ZAP-70表达；间期荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞遗传学异常。分析BECN1及ATG5基因表达与血清乳酸脱氢酶(LDH)、β2-1微球蛋白(β2-MG)及其他预后因素的关系。统计学分析采用SPSS17.0软件及GraphPad Prism 5.0软件进行,以P0.05代表有统计学差异。结果：1BECN1 mRNA在CLL患者和健康正常对照组的中位表达水平分别为0.108和0.035,具有统计学差异(P=0.002)。ATG5 mRNA在CLL患者和健康正常对照组的中位表达水平分别为为0.084和0.066,具有统计学差异(P=0.048)。2. BECN1 mRNA的表达水平与Binet分期相关。临床分期较晚(Binet B期、C期)的患者BECN1表达水平明显低于临床分期较早(Binet A期)的患者(P=0.047)。 ATG5 mRNA的表达水平与Binet分期、p53突变状态、ZAP-70、CD38等指标相关。临床分期较早(Binet A期)的患者ATG5表达水平明显高于临床分期较晚(Binet B期、C期)的患者(P=0.001)；无p53突变者ATG5表达水平要明显高于有p53突变者(P=0.014); ZAP-70阴性患者ATG5表达水平明显高于ZAP-70阳性者(P=0.008)；CD38阴性患者ATG5表达水平明显高于CD38阳性者(P=0.007)。3.利用ROC曲线以Binet分期为参照求得ATG5分界值0.090(AUC:0.699; 95% CI:0.595～0.804;敏感性71.0%,特异性69.1%),可将患者分为两组,其中ATG5高表达组的首次治疗时间(TTT)明显长于低表达组(P=0.020)。但Cox多因素生存分析显示只有Binet分期是TTT的独立预后因素(P=0.001)。结论：自噬相关基因BECN1和ATG5 mRNA在CLL细胞表达上调,提示CLL细胞自噬水平增高。TG5 mRNA表达水平与CLL的不良预后因素,如ZAP-70、 p53突变状态等相关。目的：本实验旨在研究自噬和凋亡在西达本胺治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的作用,为西达本胺单药及联合用药治疗CLL提供实验依据。方法：体外培养CLL原代细胞,应用CCK8法检测细胞活性。应用蛋白免疫印迹杂交(WB)检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ (LC3-Ⅱ)表达水平。流式细胞术(FCM) Annexin-Ⅴ FITC/PI双染检测西达本胺对细胞凋亡的诱导作用。最后用实时定量逆转录PCR (RT-PCR)检测凋亡相关基因BECN1和ATG5的mRNA表达水平。FCM检测CLL细胞中CD38和ZAP-70表达水平,PCR联合DNA序列分析测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变状态,间期荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞遗传学异常。采用SPSS 17.0及GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析。以P0.05代表其差异有统计学意义。结果：1.不同浓度的西达本胺干预CLL细胞24 h和48 h后发现,西达本胺以时间剂量依赖性抑制CLL细胞的活性。2.CLL细胞阴性对照(NC)组的24 h中位凋亡率为20.97%(7.75%～36.8%)。而3-甲基腺嘌呤(3-MA)、氯喹(CQ)、西达本胺、西达本胺联合CQ组的中位凋亡率分别为29.83%(13.55%～55.1%)、25.33%(9.03%～65.1%)、37.47%(12.18～70.1%)和44.37%(13.36～69.4%)。西达本胺诱导CLL细胞凋亡增加(P0.001)。与单独的西达本胺干预相比,CQ联合西达本胺显著增加CLL细胞凋亡率(P=0.001)。3.西达本胺下调CLL细胞LC3-Ⅱ的表达水平(P=0.001)。 LC3-Ⅱ表达下降是由于西达本胺降低细胞的自噬活性,而非自噬体降解增多所导致的。4.西达本胺下调CLL细胞BECN1 mRNA表达水平。3-MA、CQ、西达本胺、西达本胺联合CQ组BECN1 mRNA中位表达量分别为0.062(0.008～0.668)、0.054(0.006～0.445)、0.051(0.005～0.348)、0.055(0.004～0.425)。而NC组中位表达量0.078(0.006～1.000)。西达本胺、西达本胺联合CQ组的BECN1 mRNA与NC组相比,统计学上存在显著性差异(P=0.004和P=0.004)。药物处理组各组的ATG5 mRNA水平与NC组统计学上无差异(P0.05)。结论：西达本胺具有显著的抗CLL细胞肿瘤活性的作用,西达本胺通过诱导细胞凋亡和抑制细胞自噬来促进CLL细胞死亡。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72

【参考文献】

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1 PaolaGallinari;StefaniaDiMarco;PhillipJones;MichelePallaoro;ChristianSteinkühler;;HDACs,histone deacetylation and gene transcription: from molecular biology to cancer therapeutics[J];Cell Research;2007年03期

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本文编号：1232949