靶向程序性死亡因子配体1的新型免疫细胞因子的制备及抗肿瘤功能研究

发布时间：2017-11-29 19:22

  本文关键词：靶向程序性死亡因子配体1的新型免疫细胞因子的制备及抗肿瘤功能研究

  更多相关文章： 抗PD-L1单抗 免疫细胞因子 靶向治疗 IL-2

【摘要】：目的:靶向PD-L1的单抗具有免疫激活功能,并已显示出对多种肿瘤的良好治疗效果。其主要作用原理是通过阻止肿瘤细胞表面PD-L1分子与T细胞表面PD-1分子的结合,从而解除其对T细胞的抑制作用,增强抗肿瘤免疫效应。但由于临床上某些肿瘤细胞表面PD-L1低表达,应用抗PD-L1单抗治疗的疗效较差,病情易反复。因此需要开发新型抗肿瘤免疫制剂来提高单抗疗效,改善肿瘤愈后。IL-2因能激活体内多种免疫细胞而可以用来治疗肿瘤和炎症性疾病。但由于其受体广泛表达,系统性应用IL-2会引起严重的不良反应。因此,我们采用基因工程技术,将靶向PD-L1抗体的Fc段与IL-2分子融合,构建新型重组免疫细胞因子。其目的是使之能特异性靶向肿瘤区域,避免非特异性结合导致的的血管毒性;同时阻断PD-1/PD-L1结合,使机体的适应性免疫协同特异性免疫,激活T细胞,B细胞等多种淋巴细胞,释放细胞因子,以期达到对抗原表达量低,单用抗体效果不明显肿瘤的更好治疗效果。方法:首先,利用全基因合成技术将抗PD-L1单抗的IgG1亚类抗体的Fc重链基因通过linker与突变后的IL-2基因融合,连接至表达载体pc3.1DNA,构建重链质粒。MPDL3280单抗的可变区基因连接至表达载体pcDNA3.1构建轻链质粒,并与重链质粒共同转入CHO细胞中进行表达。经过细胞批次培养,纯化上清得到新型重组免疫细胞因子,简称BIPI。利用以下手段对其进行表征鉴定:SDS-PAGE分析其分子量;FCM测定BIPI的亲和力和抗原结合力;体外检测其对小鼠T淋巴细胞系CTLL-2细胞的促增殖作用;在小鼠的转移性结直肠癌预防性肿瘤模型中评估其抑瘤活性,并在治疗过程中监测小鼠体重,评估BIPI的安全性;利用抗体消除小鼠体内产生的CD8+T细胞,验证其在抑瘤过程中的作用;最后分离各治疗组小鼠脾细胞,用磁珠法从混合细胞中分离得到CD8+T细胞,测定并比较各组间CD8+T细胞数量上的差异和其IFN-γ分泌量的不同,验证BIPI对体内免疫系统的激活作用并分析免疫细胞因子的作用机制。结果:我们获得了新型免疫细胞因子,经分析其纯度大于99%。经SDS-PAGE、FCM等试验证实BIPI结构正确并且与抗原有较好的结合活性。体外实验中,含有与IL-2同等摩尔质量的BIPI与IL-2标准品有几乎相同的促进CTLL-2细胞生长的效能。在弱表达PD-L1的CT26转移性结直肠癌小鼠模型上,与对照组相比显著减少了肺表面肿瘤结节的数量,证实了免疫细胞因子BIPI的抑瘤活性。在后续对其抑瘤机制研究的过程中发现,CD8+T细胞在BIPI的抑瘤效果发挥上有重要作用;消除CD8+T细胞后,小鼠的生存期显著缩短,并且生存状态不佳。在治疗结束后,将CD8+T细胞分离后培养,检测其IFN-γ分泌量,结果显示BIPI治疗组显著高于其他对照组,结果具有统计学意义。在体重监测过程中各组小鼠体重均未发生异常改变,说明治疗性药物并未对小鼠产生明显毒性,提示其安全性良好。结论:经过实验证实,我们所构建的新型重组免疫细胞因子BIPI具有较好的抑瘤活性,尤其针对PD-L1弱表达的肿瘤类型,达到激活体内淋巴细胞,促进细胞因子分泌的作用。有望将来在临床上应用于PD-L1低表达肿瘤,弥补由于抗原结合不足导致的单抗药物疗效差,易复发等问题。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51

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本文编号：1237854