NLRP6对HCT116细胞增殖和迁移的影响及在大肠癌组织的表达

发布时间：2017-12-06 20:20

  本文关键词：NLRP6对HCT116细胞增殖和迁移的影响及在大肠癌组织的表达

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【摘要】：目的:研究干扰NLRP6的表达对HCT116细胞增殖、迁移的影响。探讨NLRP6在大肠癌发生、发展中的作用,为大肠癌的靶向基因治疗奠定基础。方法:HCT116细胞的分组:对照组Si-CON(NC-shRNA细胞悬液,NLRP6正常表达)、实验组Si-NLRP6(NLRP6-shRNA细胞悬液,干扰并下调NLRP6的表达)。1)培养六株大肠癌细胞株LoVo、SW620、SW480、HCT116、HT29、SW1116,采用qRT-PCR方法检测NLRP6 mRNA表达,Western blotting法检测NLRP6蛋白表达,筛选出NLRP6高表达细胞株HCT116。2)用慢病毒包装质粒NLRP6-shRNA转染HCT116细胞,干扰NLRP6基因表达,采用细胞划痕实验、软琼脂集落形成实验检测HCT116细胞的迁移、增殖能力。3)Western blotting法检测HCT116细胞P38MAPK、pP38MAPK、AKT、p-AKT、EGFR、MMP-2、MMP-9蛋白的表达。4)用裸鼠成瘤实验,检测干扰NLRP6对HCT116细胞体内成瘤的影响。将裸鼠随机分成2组:Si-CON组、Si-NLRP6组,每组9只。注射细胞浓度为2×106/ml,每部位接种0.1ml。饲养4周后处死裸鼠,剥离瘤体后称重,游标卡尺测量肿瘤最大径a和最小径b,按公式V=ab2/2计算肿瘤结节体积。同时解剖裸鼠肺脏,观察肺部ii肿瘤转移情况,并测量转移区域面积,制作新鲜病理标本,he染色镜下观察肺部病理情况。5)收集71例大肠癌手术切除标本及45例癌旁正常组织标本,免疫组化sp法检测nlrp6蛋白的表达。结果:1)qrt-pcr和westernblotting:nlrp6mrna和蛋白在六种大肠癌细胞株中都有不同水平的表达,在hct116细胞株中表达水平最高。2)细胞划痕实验:si-nlrp6组划痕修复率为(37.30±1.90)%,si-con组划痕修复率为(10.00±1.92)%,si-nlrp6组细胞迁移运动能力增强,差异有统计学意义(p0.05)。软琼脂集落形成实验:si-nlrp6组细胞形成的集落数较si-con组明显增多,si-nlrp6组集落形成率(63.1±14.2)%,si-con组集落形成率(20.1±9.5)%,干扰nlrp6能促进hct116细胞增殖,差异具有统计学意义(p0.05)。3)westernblot检测结果显示,hct116细胞p38mapk、p-p38mapk、akt、p-akt、egfr、mmp-2、mmp-9蛋白均有不同程度的表达,与si-con组表达水平相比较,si-nlrp6组蛋白表达水平显著增高,差异有统计学意义(p0.05)。4)接种hct116细胞4周后,裸鼠皮下移植瘤形成,si-nlrp6组移植瘤体积明显大于对照组,he染色肺部癌细胞数目更多,肺转移区域面积更大,肺转移瘤数目更多,差异有统计学意义(p0.05)。5)nlrp6蛋白阳性表达于胞浆,为棕黄色或棕褐色颗粒,癌旁正常组织阳性率68.9%,大肠癌组织阳性率42.3%,差异具有统计学意义(?2=7.837,p=0.005)。nlrp6在大肠癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、组织分化程度以及浸润深度无关(p0.05)。NLRP6在无淋巴结转移的阳性率52.4%,明显高于有淋巴结转移的27.6%,差异具有统计学意义(?2=4.322,P=0.038);在无远处转移的阳性率47.5%,明显高于有远处转移的16.7%,差异具有统计学意义(?2=3.875,P=0.049);在TNM I期/II期阳性率55.0%,高于III期/IV期阳性率25.8%,差异具有统计学意义(?2=6.100,P=0.014)。结论:1)NLRP6在大肠癌HCT116细胞株中相对高表达。2)干扰NLRP6能促进大肠癌HCT116细胞增殖和迁移,并上调P38MAPK、p-P38MAPK、AKT、p-AKT、EGFR、MMP-2、MMP-9蛋白的表达,同时促进裸鼠皮下成瘤及肺转移的发生。3)NLRP6在大肠癌组织中表达偏低,与淋巴结转移、肿瘤远处转移及TNM分期有关。NLRP6的表达可能与大肠癌的发生发展、侵袭转移具有相关性。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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