Wentilactone A对小细胞肺癌增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究

发布时间：2017-12-09 12:13

  本文关键词：Wentilactone A对小细胞肺癌增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究

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【摘要】：《2015年中国肿瘤登记年报》显示,肺癌是我国死亡率最高的肿瘤。临床-病理分型将肺癌分成小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。SCLC约占肺癌患者总数的15%,其特点为癌细胞生长快,扩散转移早,恶性程度高。耐药问题导致SCLC患者死亡率和复发率高,5年生存率不足2%,因此开发疗效好、副作用小的SCLC药物具有十分重大的意义。Wentilactone A(WA)是一种从海洋微生物次级代谢产物中分离得到的去甲二萜类小分子化合物。本课题组前期研究结果表明WA具有抑制SCLC细胞株NCI-H446增殖的生物学活性。本研究拟通过检测WA对NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm三种SCLC细胞株增殖和凋亡的影响,采用人全基因组表达谱芯片筛选、基因功能获得和干扰、Western Blot、流式细胞术等实验分析WA作用的分子机制,希望能进一步揭示WA抑制SCLC细胞株增殖的分子机制,为WA的临床应用奠定基础。第一部分Wentilactone A诱导细胞凋亡抑制SCLC增殖的研究为了研究WA对SCLC细胞株增殖的影响,本部分选取三株SCLC细胞株NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm为研究对象,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验、流式细胞术、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等实验进行研究。CCK-8细胞增殖实验结果表明:WA能强烈抑制SCLC细胞株NCI-H446、NCI-1688、LTEP-sm增殖,且抑制作用具有时间和剂量依赖性。流式细胞术检测细胞凋亡的实验结果表明:WA能诱导SCLC细胞株NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm凋亡,且具有时间依赖性。Western Blot结果表明:10μM WA作用后,三种SCLC细胞株中凋亡抑制蛋白c-FLIP表达都降低,凋亡蛋白c-caspase-3表达增加。裸鼠移植瘤模型结果表明:WA能抑制NCI-H446细胞裸鼠移植瘤的生长。此外,细胞划痕实验结果表明WA还能能抑制这三种SCLC细胞株的迁移。综上所述,体外和体内实验结果均表明WA具有抑制SCLC细胞株增殖、迁移,诱导SCLC细胞株凋亡的活性。第二部分Wentilactone A诱导SCLC细胞株凋亡的分子机制研究为了进一步研究WA诱导SCLC细胞株凋亡,抑制SCLC细胞株增殖的分子机制,我们首先利用人类全基因表达谱芯片筛选出化合物WA处理前后差异表达的基因,Western Blot和RT-PCR实验结果证实基因芯片结果可靠。GO分析和Pathway分析结果提示:凋亡通路、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)等信号通路的基因表达情况在WA处理前后有显著差异(P0.05),其中变化最明显的基因是醛酮还原酶家族1成员C1(aldo-keto reductase family 1 member C1,AKR1C1)基因,下调倍数为94.74倍。因此推测AKR1C1基因可能是WA重要的效应基因。WA具有抑制AKR1C1基因表达的作用。为了研究WA抑制AKR1C1基因表达、诱导SCLC细胞株凋亡的生物学机制,我们开展了基因功能获得和干扰实验、流式细胞术、Western Blot等实验,结果表明:干扰AKR1C1基因后,三种SCLC细胞株凋亡率均增加。干扰AKR1C1基因后,NCI-H446裸鼠移植瘤生长速度变慢,与WA作用效果一致;相反,AKR1C1基因功能获得后的NCI-H446裸鼠移植瘤生长速度变快,且过表达AKR1C1基因后,细胞凋亡率减少(P0.05)。我们进一步地通过Western Blot实验研究WA抑制AKR1C1表达的信号通路,结果表明:10μM WA处理三株SCLC细胞株后,IGF-1R/IRS-1/PI3K/AKT/Nrf2蛋白的磷酸化水平均降低,同时AKR1C1表达量降低。用该信号通路激动剂IGF-1 50 ng/ml处理细胞24h后,AKR1C1表达量升高,细胞凋亡率降低。与WA单处理相比,IGF-1和WA共处理细胞后,AKR1C1表达升高,细胞凋亡率下降。此结果表明IGF-1具有拮抗WA诱导SCLC细胞株凋亡的作用。此外,免疫组化的结果也证实WA具有抑制AKR1C1表达的作用。上述研究结果表明WA抑制IGF-1R/IRS-1/PI3K/AKT/Nrf2通路蛋白的磷酸化,进而抑制AKR1C1基因的表达,进而诱导SCLC细胞凋亡。通过本课题研究,我们得到以下了结论:(1)WA具有抑制SCLC细胞增殖并诱导其凋亡的作用;(2)AKR1C1基因参与WA抑制SCLC细胞增殖和诱导凋亡的过程;(3)WA通过抑制IGF-1R/IRS-1/PI3K/AKT/Nrf2通路蛋白的磷酸化,进而抑制AKR1C1基因表达。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：1270345