STIM1调控头颈鳞癌细胞凋亡与增殖的体内外研究

发布时间：2017-12-10 05:29

  本文关键词：STIM1调控头颈鳞癌细胞凋亡与增殖的体内外研究

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【摘要】：目的:STIM1(stromal interaction molecule 1)最早是由Kenneth Stauderman及其研究团队在2005年发现的一种参与钙库调控的钙离子内流(Store-operated Ca2+entry,SOCE)的基因[1,2]。随着对STIM1的研究深入发现STIM1在多种癌症中都有异常表达,并参与多种肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等过程[3-5],但其在头颈鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中的表达及作用机制尚不清楚。本研究旨在明确STIM1在头颈鳞癌组织中的表达情况及临床意义,探讨STIM1表达与头颈鳞癌细胞凋亡与增殖的关系,初步探索STIM1调控头颈鳞癌细胞凋亡的相关途径。方法:1.收集天津医科大学肿瘤医院头颈鳞癌手术标本蜡块组织切片及对应的正常组织切片共56对作为实验对象,应用IHC的方法检测两组组织标本中STIM1的相对表达量。收集患者临床资料,进行5年总生存率分析。同时收集8组头颈鳞癌患者手术过程留取的癌组织及切缘旁的正常组织,应用蛋白免疫沉淀方法分析STIM1在癌组织及正常组织中蛋白的表达水平。数据分析使用SPSS18.0统计获取软件包进行统计学分析,以P0.05为差异有统计学意义。2.筛选TSCCA及Hep2头颈鳞癌细胞系进行体外实验,采用lipofectamine3000介导STIM1-si RNA对两个细胞系进行转染处理,应用流式细胞术及Hoechst33258染色方法检测转染si-STIM1前后两组细胞凋亡率的差异;应用流式细胞术检测转染si-STIM1前后细胞周期分布变化。应用WB检测细胞凋亡及周期相关蛋白表达量的变化。筛选Tb3.1低表达STIM1细胞系进行高表达体外实验,应用流式细胞术检测转染前后细胞凋亡率的变化;应用fluo4/AM钙离子探针检测敲低STIM1表达后细胞内钙离子内流情况;通过WB检测caspase12的表达初步探索STIM1调控头颈鳞癌细胞凋亡的主要途径。3.选取TSCCA细胞建立裸鼠皮下成瘤动物模型,分为对照组及si-STIM1处理组,成瘤后动态观察肿瘤生长速度,取瘤测量两组肿瘤质量,制作组织切片应用HE染色观察肿瘤细胞核形态;免疫组化检测细胞凋亡相关基因caspase3、caspase12、Bcl-2、BAX及细胞周期相关基因P21、cyclin D1的表达情况,对体外实验进行进一步验证。结果:1.IHC结果显示STIM1在头颈鳞癌组织中的表达(6.286±0.259)高于癌旁组织(2.393±0.226),差异具有统计学意义(P0.05)。WB进一步证实了以上结果,差异具有统计学意义(P0.05)。STIM1表达与肿瘤大小及病理分级相关。STIM1高表达组5年OS为25.9%,低表达组5年OS为48.3%(P0.05)。2.筛选TSCCA及Hep2鳞癌细胞系中转染STIM1-si RNA,敲低STIM1的表达;筛选Tb3.1低表达STIM1细胞系,转染STIM1高表达质粒。应用FACS及Hoechst33258染色法检测STIM1细胞凋亡率:结果显示敲低STIM1表达后TSCCA及Hep2细胞凋亡率增高(P0.05),而Tb3.1细胞中STIM1高表达后细胞凋亡率下降(P0.05)。WB检测凋亡相关蛋白,STIM1敲低后凋亡基因caspase3、caspase12、BAX表达上调,Bcl-2表达下降;转染高表达STIM1质粒后结果则相反。敲低STIM1表达后细胞周期停滞在G0/G1期,WB结果验证了以上现象。3.敲低STIM1表达后,应用fluo-4钙离子探针检测细胞内钙离子信号,发现钙离子内流减少,SOCE下降,触发内质网应激。4.TSCCA荷鼠成瘤实验结果显示,抑制STIM1表达后肿瘤生长速度和重量均明显低于对照组(P0.05)。HE染色显示STIM1敲低组核分裂象及不典型增生减少。IHC结果显示,转染STIM1-si RNA组细胞浆caspase3、caspase12、BAX、P21的表达均高于对照组,而Bcl2、cyclin D1表达则低于对照组。结论:1.STIM1在头颈鳞癌组织中呈高表达状态,与肿瘤大小及病理分级相关,并与预后呈负相关,提示其在头颈鳞癌中可能起到癌基因的作用;2.STIM1影响头颈鳞癌细胞的凋亡及增值,并参与SOCE过程,其参与凋亡的途径为ER stress途径;3.体内实验与体外实验结果相一致。STIM1可作为分析人头颈鳞癌发展过程的新靶点,为头颈鳞癌的诊断和治疗提供新的可能性。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.91
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本文编号：1273334