FGF4诱导肺腺癌EMT的相关机制研究

发布时间：2017-12-12 13:08

  本文关键词：FGF4诱导肺腺癌EMT的相关机制研究

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【摘要】：研究目的:研究FGF4在肺腺癌细胞系中诱导上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)过程中的相关机制,阐明FGF4在动物模型和腺癌组织中的表达意义,因而为控制肺腺癌侵袭转移提供依据。研究方法:1.用转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导A549及H1299细胞发生EMT,检测不同成纤维细胞生长因子受体及配体的变化。2.用成纤维细胞生长因子FGF4及FGF7分别刺激肺腺癌细胞系A549和H1299发生EMT过程,用Western Blotting检测相关标志物如E-cadherin、Vimentin的表达情况;同时检测不同时间点转录因子Snail、Twist和Slug的表达情况;通过聚合酶链式反应的方法检测FGF4与FGF7的特异性受体FGFR2 IIIb和FGFR2IIIc的基因表达情况。3.用FGF4和FGF7分别刺激A549和H1299细胞,采用鬼炳环肽标记细胞骨架蛋白F-actin、Transwell、CCK-8及软琼脂成瘤实验来检测细胞的细胞骨架,移动,侵袭,增殖以及细胞干性能力的变化。4.用Western Blotting的方法检测在FGF4的刺激下,相关的通路变化情况。用钙荧光探针Fluo 3-AM的方法检测细胞内钙离子的变化。用Co-IP的方法检测FGF4与钙池操控性钙离子通道(store-operated calcium entry,SOCE)关键蛋白Orai1之间的蛋白相互作用关系。5.用Western Blotting和Fluo 3-AM的方法,检测在FGF4的刺激下,加入FGFR的抑制剂BGJ398后,细胞内钙离子和Orai1的表达变化。6.构建3个Orai1的小干扰RNA,通过Western Blotting的方法筛选出沉默效率最高的一个干扰RNA,以进行后续的实验。7.用Western Blotting和Fluo 3-AM的方法,观察在FGF4的刺激下,通过转染si-Orai1或加入SOCE抑制剂2,5-di-tert-butylhydroquinone(BHQ)后,EMT相关蛋白和转录因子的变化,以及细胞内钙离子的变化情况。8.用FGF4刺激A549和H1299细胞,之后转染si-Orai1或加入SOCE抑制剂BHQ后,采用鬼炳环肽标记细胞骨架蛋白F-actin、Transwell、CCK-8及软琼脂成瘤实验来检测细胞的细胞骨架,移动,侵袭,增殖以及细胞干性能力的变化。9.通过在裸鼠腹股沟部位皮下注射H1299细胞来检测FGF4和SOCE抑制剂对活体动物成瘤的作用和影响,实验分为3组,对照组、FGF4作用组(实验组1)和FGF4/BHQ组(实验组2)。实验组1中,当成瘤后,在肿物部位给予每周两次的FGF4;实验组2中,在给予FGF4十五天后,给予每周3次的BHQ。一个月后,处死老鼠,观察三组的肿物大小,远处转移情况,以及通过免疫组化的方法,检测三组瘤组织中FGF4、Orai1、E-cadherin,Vimentin的表达。10.选取60例肺腺癌组织标本,21例配对的肺腺癌原发灶与相应的肺转移灶,用SPSS分析FGF4的表达与患者临床病理特征(年龄、性别、肿物大小、部位、组织学类型、TNM分期、以及转移)之间的关系、FGF4的表达在肺腺癌原发灶和肺转移灶之间的差异、FGF4的表达与EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin之间的关系、FGF4的表达与Orai1之间关系。研究结果:1.经转化生长因子TGF-β1(5ng/ml)刺激后,肺腺癌细胞系A549和H1299中FGFR2 IIIb表达减少,FGFR2 IIIc表达增多,并且FGFR2 IIIb的特异性配体FGF7表达下降,FGFR2 IIIc的特异性配体FGF4表达增多。2.用FGF4和FGF7刺激细胞,Western Blotting的结果显示随着FGF4浓度的增加,E-cadherin表达逐渐减少,Vimentin表达逐渐增加,转录因子Snail、Twist表达增加,Slug的表达并无明显变化。而FGF7对这些蛋白和转录因子的表达并无明显作用。与TGF-β1的作用一致,在FGF4的刺激下,FGFR2 IIIc表达增高,并且FGFR2 IIIb的特异性配体FGF7表达下降,FGFR2 IIIc的特异性配体FGF4表达增多,同样,FGF7对这一现象无影响。3.在FGF4的刺激下,A549和H1299细胞出现了细胞骨架重拍的现象,F-actin的表达由细胞膜移至细胞内,并且细胞呈现梭形、极性丧失的表现;细胞的增殖、移动、侵袭和干性能力增加。4.通过对经典的FGFR/FGF通路MAPK/ERK和PI3K-AKT进行检测,发现FGF4并没有激活p-AKT和p-ERK,而发现作为SOCE关键蛋白Orai1的表达升高。用钙荧光探针Fluo 3-AM检测细胞内的Ca~(2+)离子浓度发现,FGF4的刺激能够增加内质网的Ca~(2+)离子内流。Co-IP结果表明,FGF4与Orai1存在蛋白之间的相互作用关系。5.在FGF4刺激的同时,给予FGFR的抑制剂BGJ398,观察到BGJ398能够逆转FGF4引起的细胞内Ca~(2+)离子浓度增加和Orai1表达升高的现象。6.对构建好的3个Orai1的小干扰RNA进行Western Blotting检测,选出沉默效率最高的si-1进行后续的实验。7.在FGF4的刺激下,同时对A549和H1299细胞转染si-Orai1或加入SOCE抑制剂BHQ,观察到FGF4的这种促EMT作用被si-Orai1或BHQ所逆转,表现为E-cadherin表达增加,Vimenti、Snail、Twist表达减少,同时内质网中的Ca~(2+)离子浓度减少。8.为了检测si-Orai1和BHQ对细胞功能学的影响,我们在给予FGF4刺激下,转染si-Orai1或加入BHQ,发现这两者能够逆转FGF4引起的细胞骨架重拍、降低了细胞的增殖能力,移动、侵袭和干性能力明显减弱。9.动物实验的结果表明,FGF4作用于裸鼠,与对照组和实验组2相比所形成的皮下肿物体积较大,并且实验组1出现了2例肺转移,2例血管内癌栓,3例骨骼肌浸润。而实验组2皮下肿物的体积与对照组相比并没有明显差异并且没有发生转移。在处死裸鼠后,通过对这3组的皮下肿物进行免疫组化染色,结果表明实验组1与对照组和实验组2相比,出现Orai1表达的显著增加。与对照组相比,实验组1出现了E-cadherin表达减少而Vimentin表达增加,然而在实验组2中,免疫组化的结果表明加入BHQ后能够逆转FGF4引起的这种促EMT现象。10.在肺腺癌组织标本中的研究表明,FGF4的表达与患者的年龄、性别、肿物大小、肿物部位并不相关,而与肺腺癌患者的组织学类型(P0.05),TNM分期(P0.05)和转移(P0.05)之间存在统计学意义。在配对的肺腺癌组织和对应的转移淋巴结中,在转移的淋巴结中FGF4高表达(P0.05)。通过对FGF4与EMT相关蛋白的表达进行分析,FGF4的表达与Vimentin呈正相关,而与E-cadherin呈负相关(P0.05)。最后,我们检测了FGF4的表达与SOCE关键蛋白Orai1的表达情况,结果表明:FGF4的表达与Orai1表达呈正相关性(P0.05)。研究结论:通过在肺腺癌细胞系,动物模型以及人肺腺癌组织中的研究,我们发现FGF4的表达能够促进EMT,表现为上皮相关蛋白的表达降低和间质相关蛋白/转录因子的表达增高,以及细胞骨架的重拍、移动侵袭、增殖、干性能力的增加。在FGF4的作用下,细胞内的Ca~(2+)离子浓度增高,而抑制FGFR、加入SOCE抑制剂或降表达Orai1,能够逆转FGF4的促EMT作用。由此我们推断SOCE在FGF4的促EMT过程中起着关键的作用。在裸鼠的体内实验中,FGF4的刺激能够促进肿物的生长,使裸鼠出现肺转移灶、骨骼肌浸润和血管内癌栓。FGF4在肺腺癌组织中的高表达意味着更高的恶性程度和转移潜能,并且其表达与Vimentin和Orai1呈正相关,而与E-cadherin呈负相关。综上所述,通过在体外的细胞学实验、体内的动物实验以及在肺腺癌组织标本中的研究表明,在FGF4所诱导的肺腺癌EMT过程中,SOCE发挥着重要的作用。针对SOCE在肺腺癌EMT过程中的研究,能够为控制肺腺癌转移提供一个新的理论指导。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【参考文献】

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本文编号：1282594