FANCD2 shRNA干扰对头颈鳞癌颈淋巴结转移细胞HSC-4放疗敏感性的影响和机制研究

发布时间：2017-12-16 07:21

  本文关键词：FANCD2 shRNA干扰对头颈鳞癌颈淋巴结转移细胞HSC-4放疗敏感性的影响和机制研究

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【摘要】：目的:头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)是临床上常见的恶性肿瘤。HNSCC特别是鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)98%属于低分化鳞状细胞癌,首选放射治疗。然而,对于局部复发,远处转移和初次治疗失败的患者单纯放疗疗效较差,特异性高、靶向性强的放疗增敏技术及方法急需研发。课题组前期实验已经证明FANCD2 shRNA干扰沉默FANCD2基因表达后可通过影响HNSCC颈淋巴结转移细胞HSC-4的体外生长增殖、凋亡、细胞周期及相关蛋白的表达提高HSC-4细胞对顺铂的敏感性。但关于FANCD2基因是否参与了HNSCC颈淋巴结转移细胞HSC-4对放射治疗敏感性的调控尚不得而知。本研究以FANCD2 shRNA干扰获得的FANCD2稳定沉默HNSCC颈淋巴结转移细胞HSC-4为研究对象,研究HSC-4细胞放疗后细胞体外增殖抑制效应、凋亡率、细胞周期分布、存活率及相关蛋白表达的变化,探讨沉默FANCD2对HSC-4细胞放疗敏感性的影响及可能机制。方法:以前期实验获得FANCD2沉默效应稳定的HNSCC颈淋巴结转移细胞HSC-4为研究对象,将实验细胞分为三组,实验组:FANCD2-shRNA(转染含FANCD2有效干扰序列且FANCD2沉默效应稳定的HSC-4细胞),空白对照组:HSC-4(未经转染的HSC-4细胞),阴性对照组:FANCD2-shRNA-C(转染FANCD2无效干扰序列的HSC-4细胞)。三组细胞常规培养,阴性对照组及实验组培养过程中以嘌呤霉素筛选。通过细胞增殖抑制试验(cellcountingkit-8,cck-8)检测三组hsc-4细胞在不同剂量及不同作用时间钴60照射后生长增殖的情况,流式细胞术(annexinv-fitc/pi染色法)测定三组hsc-4细胞钴60照射后凋亡率和细胞周期改变,克隆形成法检测三组hsc-4细胞放疗后的存活率,以研究fancd2shrna干扰对hsc-4细胞放疗敏感性的影响;通过westernblot法检测fancd2shrna干扰以及放疗后bax、bcl-2、p-38和p-p-38蛋白表达的变化,探讨fancd2与bax、bcl-2、p-38和p-p-38蛋白表达的关系,研究fnacd2shrna干扰影响hsc-4细胞放疗敏感性的可能机制。结果:(1)cck-8检测结果显示随着放疗剂量加大三组细胞增殖抑制率均提高,且实验组在各剂量照射后的增殖抑制效应均强于对照组(p0.05),其中在放疗剂量增加至8gy时实验组吸光度值(od)(0.256±0.027)明显低于阴性对照组(0.362±0.008)和空白对照组(0.382±0.0213),增殖抑制作用最强,组间比较差异有统计学意义(f=103.835,p0.05);照射剂量为5gy作用24、48、72小时后,三组细胞增殖水平均随时间延长而降低,照射后24、48、72小时各细胞组间od值差异均有统计学意义,统计值分别为(f=6.307,p0.05)、(f=9.007,p0.05)和(f=22.914,p0.05),且实验组增殖抑制效应较对照组更强;(2)流式细胞术检测结果显示8gy放射治疗后细胞常规培养48小时,实验组细胞凋亡率(34.074±0.061)%明显高于阴性对照组(5.926±0.038)%和空白对照组(14.241±0.047)%,差异有统计学意义(f=261.786,p0.05),即说明shrna干扰沉默fnacd2后hsc-4细胞由放疗诱导的凋亡率增加;(3)shrna干扰沉默fancd2后,三组细胞放射治疗后48小时实验组细胞周期变化为进入s期比例增加(f=160.778,p0.05),进入g0/g1期细胞减少(f=224.974,p0.05),g2/m期比例无明显差异(f=2.664,p0.05),与阴性对照组及空白对照组比较差异均有统计学意义(p0.05)。(4)克隆形成实验结果显示随着放疗剂量加大,各组细胞存活率均降低且各组间差异均有统计学意义(p0.05),放疗剂量增加至8gy时shrna干扰组细胞存活率(0.007±0.021)较空白对照组(0.039±0.013)和阴性对照组(0.037±0.016)明显降低,差异有统计学意义(f=10.671,p0.05)。(5)westernblot结果表明shrna干扰沉默fancd2表达后,实验组细胞bax(f=931.591,p0.05)和p-p38(f=685.425,p0.05)蛋白表达较对照组增强,p-38(f=1954.140,p0.05)和bcl-2(f=3219.791,p0.05)蛋白表达降低;各组细胞放射治疗后,实验组bax(f=429.591,p0.05)和p-p38(f=214.974,p0.05)蛋白表达较对照组增强,p-38(f=1027.974,p0.05)和bcl-2(f=285.974,p0.05)蛋白表达较对照组降低。结论:(1)fancd2shrna干扰能提高人hnscc颈淋巴结转移hsc-4细胞放疗后的增殖抑制效应,促进细胞由放疗诱导的凋亡,导致细胞周期阻滞,降低细胞存活率,即shrna干扰沉默fancd2表达能提高人hnscc颈淋巴结转移细胞hsc-4对放射治疗的敏感性;(2)fancd2基因沉默可能通过调节细胞凋亡相关通路bax/bcl-2蛋白的表达,促进hsc-4细胞放疗诱导的凋亡,并通过激活p-38mapk通路,导致p-p-38蛋白表达增强,共同参与hsc-4细胞放射治疗后细胞增殖,凋亡、细胞周期分布的调控从而提高人hnscc颈淋巴结转移细胞hsc-4对放射治疗的敏感性。(3)沉默fancd2表达有望为hnscc尤其是晚期发生颈部淋巴结转移患者的治疗带来希望,同时为HNSCC患者的靶向治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.91

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本文编号：1295165