TIMELESS在宫颈癌中的异常表达及靶向治疗的研究

发布时间：2017-12-16 16:02

  本文关键词：TIMELESS在宫颈癌中的异常表达及靶向治疗的研究

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【摘要】：目的:探索TIMELESS在宫颈癌中的表达及其功能,靶向TIMELESS对宫颈癌细胞增殖、凋亡、衰老、克隆、顺铂敏感性的影响。方法:生物信息学分析TIMELESS在三个独立的宫颈癌基因芯片数据库中的表达;通过对子宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)和宫颈癌组织进行免疫组化研究,分别检测TIMELESS在CIN I、CIN II、CIN III和宫颈癌组织中的表达;利用宫颈癌组织芯片进行免疫组化分析,研究TIMELESS在宫颈癌组织中的阳性表达率;用Western Blot技术分析人宫颈癌细胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A细胞中TIMELESS的表达,筛选高表达细胞株;设计合成三组针对人TIMELESS基因的小干扰RNA(siRNA),并通过脂质体Lipofectamine2000将其转染至SiHa细胞株体内,应用Western blot技术检测实验组(TIMELESS siRNA#1组、siRNA#2组和siRNA#3组)及阴性对照siRNA(Ctrl siRNA组)TIMELESS mRNA和蛋白的表达;CCK8法检测三组细胞的增殖能力以及对顺铂敏感性的变化;通过流式细胞检测技术检测各实验组在凋亡中的差异;细胞克隆形成实验检测三组细胞的克隆形成能力;细胞株转染TIMELESS siRNA并联合顺铂处理,β-半乳糖苷酶法检测各组细胞的衰老;通过Western blot技术检测凋亡蛋白Cleaved caspase-3各组细胞的表达;通过Western blot技术检测TIMELESS敲除后各组细胞γ-H2AX及Rad51蛋白的表达。结果:1.基因芯片数据分析显示TIMELESS在宫颈癌组织中的表达水平明显高于正常宫颈组织(P0.05),提示TIMELESS可能在宫颈癌进展中发挥重要作用;2.TIMELESS在从CIN I、CIN II、CIN III到宫颈癌的进展过程中阳性表达水平逐渐升高,呈明显递增趋势(P0.05);3.对宫颈癌的组织芯片进行TIMELESS免疫组化分析,发现TIMELESS在宫颈癌中有52.5%(21/40例)呈阳性表达;4.宫颈癌细胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A细胞中TIMELESS蛋白表达水平中,SiHa细胞中TIMELESS蛋白表达较高;5.靶向TIMELESS的三对特异性siRNA:siRNA#1,si RNA#2,siRNA#3均可明显抑制TIMELESS的表达,在SiHa细胞中,相对Ctrl siRNA组,RTPCR结果显示siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3组中TIMELESS的mRNA表达量分别为(0.263±0.018)、(0.157±0.013)、(0.286±0.021),Western Blot结果显示siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3组中TIMELESS蛋白表达量分别为(0.162±0.052)、(0.134±0.057),(0.173±0.062)(P0.01)。siRNA#1和siRNA#2的效果较好。6.CCK8法检测细胞增殖实验显示siRNA#1组与siRNA#2组细胞的增殖能力显著下降;7.细胞凋亡实验显示实验组siRNA#1组与siRNA#2组的细胞早期凋亡明显增加;8.在Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三组实验细胞中,SiHa细胞克隆数为(209.333±3.383),(111±3.786),(129.667±3.590);9.β-半乳糖苷酶法检测各组细胞的衰老,顺铂作用后,显示实验组的衰老细胞比率均上升(P0.0001)。10.随着顺铂浓度的增加,Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三组实验细胞的增殖均受到抑制,细胞半数抑制率IC50(μg/ml)分别为7.907,5.052,2.565,可见TIMELESS siRNA可以增加宫颈癌SiHa细胞株对顺铂的敏感性;11.实验组中,凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达有明显的增加;12.TIMELESS敲减后,DNA损伤相关蛋白γ-H2AX表达增加,同时可以抑制SiHa细胞中DNA损伤修复相关蛋白Rad51的表达。结论:TIMELESS在宫颈癌中异常高表达,靶向敲减TIMELESS,可以抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖和克隆形成能力、促进SiHa凋亡和衰老,并增强SiHa细胞对顺铂化疗的敏感性。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

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1 蒯玲玲;TIMELESS在宫颈癌中的异常表达及靶向治疗的研究[D];苏州大学;2016年

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本文编号：1296598