几种AML细胞株的生物学特征及Kasumi-1细胞耐药逆转机制研究

发布时间：2017-12-17 01:00

  本文关键词：几种AML细胞株的生物学特征及Kasumi-1细胞耐药逆转机制研究

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【摘要】：背景与目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是发生于血液系统造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病,主要以大量的髓系白血病细胞在骨髓中恶性增殖、积聚,抑制正常造血功能为特征。白血病是当今严重威胁人类健康的恶性血液系统疾病,其发生率及死亡率呈逐渐上升趋势,我国肿瘤登记地区2003-2007年白血病的发病率和死亡率分别为5.17/10万、3.94/10万,新发例数和死亡例数分别占全部恶性肿瘤的1.94%、2.29%,在全部恶性肿瘤的发病率和死亡率分别居第13位和第9位,而2009年我国肿瘤地区登记白血病发病及死亡情况的数据分析显示,我国白血病的年发生率约为5.68/10万,占全恶性肿瘤发病的1.99%,死亡率约4.28/10万,占全部恶性肿瘤死亡例数的2.37%,发病率和死亡率均稍上升。当前随着化疗方案的不断改进,50～85%的患者经标准方案诱导化疗可获得骨髓完全缓解(complete remission,CR),但复发率仍高达30～40%,而不少患者甚至难以获得初治的诱导缓解,究其原因,白血病细胞对化疗药物产生原发性或继发性多药耐药现象是导致化疗失败和复发的主要因素。如同恶性实体肿瘤细胞对化疗药物耐药,白血病细胞对化疗药物耐药也是一个多因素参与、多步骤完成的复杂过程,过表达耐药基因(如MDRl、MRP1、BCRP、LRP、GSTP1、DHFR)、基因突变(如FLT3、MLL基因等)、骨髓微环境的影响等均可导致白血病细胞对化疗药物耐药。本课题组的临床研究发现AML1/ETO+ AML患者中高表达淀粉样前体蛋白(APP)基因者诱导缓解率及预后较低表达APP者差,相关研究报道卵巢癌、胰腺癌及肝癌细胞对化疗药物耐药与肿瘤细胞过表达果蝇zeste基因增强子的人类同源基因(EZH2)相关,因此,我们推测：APP及EZH2基因可能与AML1/ETO+ AML细胞对化疗药物的耐药性相关,但尚未见APP基因及EZH2基因高表达与白血病细胞耐药的关系及机制的研究报道。同时,本课题组的前期实验研究发现,急性髓系白血病细胞株Kasumi-1细胞具有AML1/ETO+并高表达APP和EZH2基因的特征,沉默Kasumi-1细胞的APP及EZH2基因后细胞的迁移能力下降。本课题在此基础上,以Kasumi-1细胞为主要研究对象,检测其基本的生物学特性及对常用化疗药物的敏感性,并研究APP、EZH2基因在Kasumi-1细胞对化疗药物产生耐药中的作用,为寻找提高白血病对化疗药物敏感性的靶向药物提供理论依据。t(8；21)是AML中最常见的染色体异常,由8号和21号染色体异位生成AML1-ETO融合基因,在成人AML中的发生率为4-12%,而在儿童AML中的发生率则高达12-30%。AML1-ETO融合基因阳性的白血病在某种程度上表现髓系分化,因此将其归类至FAB分型中的M2亚型。人类和小鼠AML模型均证实了AML1-ETO融合基因与酪氨酸激酶突变、过表达WT1、ICSBP和P21基因缺失等二次事件共同促进白血病的发生和发展。AML1/ETO+ AML患者的诱导治疗方案仍为传统的由蒽环类药物和阿糖胞苷组成的“3+7”方案,获得诱导缓解后给予高剂量阿糖胞苷巩固化疗。尽管t(8；21)是一个预后良好的因素,大部分患者经诱导治疗和巩固化疗后可获得完全缓解,但是该类型患者的5年生存率仅约50%,伴随c-kit突变的患者预后则更差。本课题组前期的临床研究也发现,／AML1/ETO+ AML患者中高表达淀粉样前体蛋白(APP)基因者预后不佳,这提示APP可能为预后不良因素。淀粉样前体蛋白(APP)属Ⅰ型跨膜蛋白,广泛表达于各种类型细胞中,具有调控细胞的生长及凋亡,参与基因转录、钙离子平衡调节等生物学功能。APP基因在胰腺癌、口腔鳞状上皮细胞癌、大肠癌等多种实体肿瘤中表达增高,且可促进胰腺癌、口腔鳞状上皮细胞癌和大肠癌细胞的增殖。本课题组曾报道,AML各亚型中APP mRNA在AML1/ETO+AML患者的表达最高,APP基因高表达与白血病的迁移和髓外浸润有关,但尚未见APP基因的表达水平与化疗药物敏感性关系的报道。果蝇zeste基因增强子的人类同源基因(EZH2)是PeG蛋白家族的重要成员之一,也是核心蛋白复合体2(PRC2)的催化亚基,具有组蛋白甲基转移酶活性,它通过对组蛋白H3K27位点赖氨酸进行甲基化修饰发挥沉默靶基因作用而促进肿瘤生成。多种恶性肿瘤高表达EZH2,如前列腺癌、乳腺癌等,EZH2通过促进肿瘤细胞的增殖、增强细胞迁移和侵袭能力、阻滞细胞周期而参与肿瘤的发生与演进,多种实体瘤异常表达EZH2基因与肿瘤侵袭性及较差预后相关,已有研究证实EZH2蛋白与卵巢癌、胰腺癌、肝癌细胞对化疗药耐药相关,但尚未见其与白血病细胞耐药的相关研究报道。Kasumi-1、HL-60及HL-60/ADM细胞株均属髓系细胞株,是血液病科研实验中常用的细胞株,然而,关于这三株细胞生物学特性的研究甚少。因此,本课题以AML细胞株为研究对象,采用细胞形态学、流式细胞免疫分型、染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)技术并结合DNA测序方法检测Kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM细胞的基本生物学特性,并分别采用qRT-PCR和Western Blot的方法检测3株细胞的APP、EZH2 mRNA和蛋白表达量。用MTT法检测Kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM细胞对Ara-c、HHT、 ADM、DNR、IDA的敏感性,经慢病毒分别转染si-APP、si-EZH2序列至Kasumi-1细胞沉默APP、EZH2基因后,MTT法检测沉默后Kasumi-1细胞对药物的敏感性,并进一步研究APP、EZH2基因在Kasumi-1细胞对化疗药物耐药的机制中的作用。对象与方法1.AML细胞株的生物学特性鉴定采用细胞形态学、流式细胞免疫分型(FCM)、染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)技术并结合DNA测序方法检测Kasumi-1、 HL-60、HL-60/ADM细胞的生物学特性。应用qRT-PCR方法检测HL-60、 HL-60/ADM、Kasumi-1细胞的APPmRNA及 EZH2 mRNA的表达水平,WesternBlot方法检测HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1细胞的APP及EZH2蛋白表达水平。2.HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1细胞对常用化疗药物的敏感性检测四唑盐(MTT)比色法分别检测不同浓度的Ara-c、HHT、ADM、DNR、IDA对HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1细胞的增殖抑制率,利用IC50计算软件计算各药物对各细胞株的IC50,并计算耐药倍数(RI),IC50 (HL-60/ADM)/ IC50 (HL-60)的比值为HL-60/AD M细胞的RI,RI30说明HL-60/ADM是耐药株,HL-60细胞株是敏感株,可以作为本研究的对照细胞株；IC50 (Kasumi-1) /IC50 (HL-60)的比值为Kasumi-1细胞的RI,RI30说明Kasumi-1细胞对该化疗药物耐药。3.沉默Kasumi-1细胞的APP或EZH2基因对Ara-c、ADM的耐药逆转作用由本课题组其他成员转染空病毒及携带沉默APP、EZH2基因序列的病毒至Kasumi-1细胞后,获得NC-Kasumi-1、si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1细胞。采用MTT法分别检测不同浓度的Ara-c、ADM对NC-Kasumi-1、si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1细胞的增殖抑制率,利用IC50计算软件计算各药物对各细胞株的IC50,分别比较各药物对NC-Kasumi-1与si-APP Kasumi-1、 si-EZH2 Kasumi-1的增殖抑制率的差异,并计算逆转耐药倍数(RF),IC50 (Kasumi-1)/IC50 (si-Kasumi-1)比值为si-Kasumi-1细胞的RF, RF1说明沉默APP/EZH2基因后Kasumi-1细胞对化疗药物的敏感性增加。4.耐药逆转的信号蛋白检测qRT-PCR检测Kasumi-1. si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1细胞MDR1mRNA的表达量,Western Blot检测Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1细胞Hedgehog通路中Gli-1蛋白的表达量。5.统计分析方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析,每次实验重复3次,数据资料以x±S描述。均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐使用LSD方法进行多重比较,方差不齐则使用采用近似F检验(Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett's T3方法进行多重比较。以p0.05认为具有统计学差异。结果1.AML细胞株的生物学特性比较形态学及细胞免疫表型结果均显示Kasumi-1细胞、HL-60细胞、HL-60/ADM细胞均属于髓系白血病细胞株,染色体核型分析显示三株细胞的染色体均为复杂核型,Kasumi-1细胞伴t(8；21)核型特征。FISH和qRT-PCR检测的结果均显示Kasumi-1细胞表达AML1/E TO融合基因,DNA测序显示Kasumi-1细胞KIT基因突变阳性,NPM1、FLT3-ITD及DNMT3AR882突变阴性,HL-60、HL-60/ADM细胞KIT、NPM1、FLT3-ITD及DNMT3AR882突变均为阴性。2.APP及EZH2基因表达水平比较(1)所有进行qRT-PCR样本的A260/A280比值均在1.80-2.00之间,说明RNA纯度满足实验要求。目的基因和内参基因的熔解曲线均显示单一峰,表明cDNA的解链温度均一致,且曲线峰形锐利,提示引物的特异性较高；扩增曲线的重合性及平行性较好,表明实验结果稳定可靠。(2)qRT-PCR结果显示：H IL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1细胞的APPmRNA表达量分别为0.142±0.049、0.053±0.009、0.171±0.065, Kasumi-1细胞与HL-60细胞无明显差异(p=0.413),但明显高于HL-60/ADM细胞(P=0.004)；HL-60、HL-60/ADM. Kasumi-1细胞的EZH2mRNA表达量分别为0.136±0.033、0.121±0.019、0.114±0.015,三者EZH2mRNA表达量无明显差异(P0.05)。(3) Western-Blot检测结果显示内参蛋白GAPDH表达量一致,内参蛋白及目的蛋白条带清晰,说明Western-Blot结果稳定可靠。结果显示Kasumi-1细胞APP蛋白表达量与HL-60无显著差异,但较HL-60/ADM细胞高,三株细胞EZH2蛋白的表达无明显差异。3.HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1细胞株对常用化疗药物的敏感性比较Ara-c、ADM、DNR、IDA、HH T对HL-60、HL-60/ADM、Kasumi-1细胞的增殖抑制作用均呈剂量依赖效应,化疗药物对细胞的增殖抑制率随着药物剂量增加而增加;HL-60/ADM对5种化疗药物的耐药倍数均大于30,说明HL-60对5种化疗药物均敏感,]HL-60/ADM对5种化疗药物均耐药;Kasumi-1细胞对Ara-c、ADM、DNR、IDA、HHT的耐药倍数分别为1548、31、15、11、0.27,根据耐药判断标准,Kasumi-1细胞对Ara-c、ADM耐药。4. si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasum i-1细胞对Ara-c、ADM的敏感性Ara-c、ADM对NC-Kasumi-1、si-APP Kasumi-1、si-EZH2 Kasumi-1细胞的增殖抑制作用亦呈剂量依赖效应,化疗药物对细胞的增殖抑制率随着药物剂量增加而增加；Ara-c对NC-Kasumi-1、Kasumi-1的增殖抑制率及ADM对NC-Kasumi-1、Kasumi-1的增殖抑制率均无显著性差异,说明转染病毒对细胞的增殖无明显影响。si-APP Kasumi-1细胞对Ara-c、ADM的逆转倍数(RF)分别为1.4.0.28,si-EZH2 Kasumi-1细胞对Ara-c、ADM的RF分别为59.35、64.03,说明沉默EZH2基因后Kasumi-1细胞对Ara-c ADM的敏感性均明显增加,而沉默APP基因后仅能部分增加Kasumi-1细胞对Ara-c的敏感性。5. si-EZH2 Kasumi-1细胞逆转耐药的机制Kasumi-1细胞的MDR1mRNA的表达量明显高于si-EZH2 Kasumi-1细胞(p=0.001),而与si-APP Kasumi-1细胞的MDR1mRNA表达量比较则没有统计学差异(p=0.307),si-EZH2 Kasumi-1细胞Gli-1蛋白的表达量也明显低于Kasumi-1细胞(p0.001)。结论Kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM细胞均表现髓系原始细胞的形态学特征,并表达髓系细胞表面抗原,染色体均为复杂核型,仅有Kasumi-1细胞伴t(8；21)和AML1/ETO融合基因阳性及KIT基因突变阳性。Kasumi-1细胞APPmRNA及蛋白的表达量与HL-60细胞均无显著差异,但均显著高于及FIL-60/ADM细胞,EZH2mRNA及蛋白的表达量在三株细胞中无显著性差异。Kasumi-1细胞在体外对Ara-c及ADM耐药,而对DNR相对敏感,对HHT及IDA最敏感。沉默APP基因的表达仅仅可以部分逆转对Ara-c的耐药,而沉默EZH2基因的表达能够明显逆转Kasumi-1细胞对Ara-c、ADM的耐药性,并伴随着MDR1mRNA及Hedgehog通路Gli-1蛋白表达量明显下降。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【共引文献】

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1 石源源;贾玉平;纪静;赵真真;韩璐;罗兵;;EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系全基因组表达谱差异比较（英文）[J];现代生物医学进展;2015年20期

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1 蒋玲;APP基因调控AML1/ETO~+白血病细胞迁移及其分子机制研究[D];南方医科大学;2013年

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本文编号：1298113