慢病毒介导RNAi沉默GTPBP4基因表达对结肠癌RKO细胞生物学行为的影响

发布时间：2017-12-17 10:01

  本文关键词：慢病毒介导RNAi沉默GTPBP4基因表达对结肠癌RKO细胞生物学行为的影响

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【摘要】：目的:根据GTPBP4基因序列设计并合成相应GTPBP4-si RNA,研究GTPBP4-si RNA对人结肠癌RKO细胞生物学行为的影响。方法:上海吉凯基因化学技术有限公司的GTPBP4基因RNA干扰慢病毒载体LV-GTPBP4-RNAi及阴性病毒载体CON053,RNAi序列为GCGTAGTCTTGGTGTTGACAT;培养RKO细胞,待细胞生长状态良好并达到对数生长期时,于转染前一日接种于6孔板,设实验组、阴性对照组。实验组加入慢病毒LV-GTPBP4-RNAi 5ul,滴度为2×108 TU/ml,阴性对照组加入阴性病毒载体CON053 5ul,滴度为2×108 TU/ml。慢病毒感染RKO细胞3天后,因慢病毒上携带报告基因GFP,故GFP的表达情况,判断感染效率,待细胞长满培养板时收集细胞用于后续实验。(1)判断靶点的干扰效果可用Real-time PCR法检测GTPBP4基因m RNA的表达情况:慢病毒感染5天后,立即抽提实验组及对照组的RKO细胞的总RNA,并逆转录合成c DNA,并经PCR反应扩增,采用2-ΔΔCt分析法分析Real-time PCR数值。(2)用western blot法检测GTPBP4蛋白质的表达情况:慢病毒感染5天后,提取实验组及对照组RKO细胞的总蛋白,以BCA法来测定蛋白浓度,以GAPDH蛋白为内对照进行SDS-PAGE电泳,免疫印迹(湿转),抗体杂交,X光显影分析结果。(3)感染5天后,用Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测检测各组RKO细胞凋亡率。(4)用MTT法于分板后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5个时间点检测各组RKO细胞的增殖情况。(5)用PI-FACS细胞周期检测来检测GTPBP4基因与RKO细胞周期分布的相关性。(6)通过感染后细胞在细胞培养板上的克隆形成能力来提示慢病毒感染后细胞的成瘤能力。结果:(1)用荧光显微镜在慢病毒感染3天后观察,根据发绿色荧光的RKO细胞所占比率判断慢病毒感染RKO细胞的效率达80%以上。(2)Real-time PCR法检测结果:数值分析采用2-ΔΔCt分析法,实验组2-ΔΔCt平均值为0.208,对照组的2-ΔΔCt平均值为1.002,显示实验组RKO细胞中GTPBP4的m RNA表达水平显著低于对照组(p0.05)。(3)western blot结果:X光显影后,可见各组内对照GAPDH蛋白灰度相似,而实验组GTPBP4蛋白灰度值明显低于对照组,显示si RNA对目的基因的表达有敲减作用,根据灰度分析结果,敲减效率达到72.9%。(4)凋亡检测显示:慢病毒感染后,对于凋亡峰值实验组细胞明显高于对照组,且峰值出现时间早于对照组,表明实验组RKO凋亡细胞增加。(5)MTT法检测结果:在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5个时间点对照组OD值均值分别为1.00、1.54、2.61、4.15、8.09,实验组分别为1.00、1.49、2.23、3.12、6.33,显示慢病毒感染后,实验组RKO细胞MTT值比值(即增殖倍数)减小,提示GTPBP4基因与RKO细胞的增殖能力显著相关。(6)PI-FACS细胞周期检测结果:慢病毒感染后,处于G1期及G2/M期的实验组细胞显著增多,而处于S期的明显减少,提示GTPBP4基因与RKO细胞的周期分布相关。(7)细胞克隆形成检测结果:实验组细胞集落数目平均值为63,对照组为106,显示慢病毒感染后,实验组RKO细胞集落数目与对照组细胞集落数目相比减少,提示GTPBP4基因与RKO细胞的克隆形成能力相关。结论:1.慢病毒介导的RNAi能高效感染RKO细胞,并有效抑制RKO细胞中相应基因的表达。2.沉默GTPBP4基因能抑制RKO细胞克隆形成能力及增殖能力,同时诱导细胞凋亡,促进细胞周期阻滞。3.GTPBP4可能是结肠癌新的治疗靶点。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

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