内质网应激介导的自噬和凋亡在重组新城疫病毒rL-RVG引起人胃癌细胞死亡中的作用

发布时间：2017-12-23 04:23

本文关键词：内质网应激介导的自噬和凋亡在重组新城疫病毒rL-RVG引起人胃癌细胞死亡中的作用　出处：《江苏大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：组织缺氧、内质网钙离子损耗、病毒性感染以及某些影响钙离子平衡、蛋白质糖基化和内质网高尔基体膜泡转运的因素都会干扰内质网功能,导致未折叠蛋白或错误蛋白积聚,称为未折叠反应(UPR)。这种未折叠蛋白增加被称为“内质网应激”,决定着细胞是存活还是走向死亡。新城疫病毒(Newcastle disease virus,DNV)作为一种禽类副粘病毒,已作为溶瘤病毒研究多年,以其对肿瘤细胞高选择性及肿瘤细胞内高复制,被认为下一代抗癌药物的新选择。本文观察凋亡、自噬及内质网应激在稳定表达病毒糖蛋白的重组新城疫病毒(r L-RVG)引起人胃癌细胞死亡中的作用,探讨r L-RVG所引起的内质网应激、自噬及凋亡之间的相互关系,为r L-RVG成为治疗胃癌的候选药物提供了分子基础。相关研究如下:1.r L-RVG感染诱导胃癌细胞发生内质网应激r L-RVG和NDV分别感染胃癌细胞后,首先通过Western Blot实验方法检测内质网相关蛋白GRP78及CHOP的表达,结果发现GRP78及CHOP的表达明显上升,而后通过免疫荧光再次证明,r L-RVG和NDV促进GRP78及CHOP蛋白的表达,且r L-RVG作用更强,揭示r L-RVG感染诱导胃癌细胞发生内质网应激。2.r L-RVG感染胃癌细胞激活内质网应激IRE1通路r L-RVG和NDV分别感染胃癌细胞后,首先通过Western Blot实验方法检测IRE1通路蛋白XBP-1蛋白的表达,结果发现XBP-1表达上调,然后通过半定量PCR检测未切割u XBP-1 m RNA及切割后s XBP-1 m RNA的表达情况,发现在r L-RVG感染SGC-7901细胞12 h后,检测到s XBP-1 m RNA的表达,揭示r L-RVG激活内质网应激IRE1通路。3.r L-RVG感染胃癌细胞激活内质网应激ATF6通路r L-RVG和NDV分别感染胃癌细胞后,通过Western Blot实验方法检测ATF6通路相关蛋白ATF6切割情况,实验发现,r L-RVG和NDV组明显检测到p50-ATF6的表达上调,且r L-RVG组上调更加明显,证实r L-RVG感染胃癌细胞激活内质网应激ATF6通路。4.r L-RVG感染胃癌细胞激活内质网应激PERK通路r L-RVG和NDV分别感染胃癌细胞后,通过Western Blot实验方法检测PERK通路相关蛋白蛋白表达情况,发现r L-RVG组和NDV组e IF2α磷酸化水平明显提高,然而总的e IF2α未见明显变化。实验证明r L-RVG感染胃癌细胞激活内质网应激PERK通路。5.r L-RVG感染胃癌细胞通过诱导内质网应激介导发生自噬与凋亡使用4PBA预处理两小时后,用病毒感染胃癌细胞24h,Western Blot实验方法检测内质网应激、自噬及凋亡相关蛋白,发现不仅内质网应激相关蛋白降低,自噬及凋亡相关蛋白同时也明显降低。进一步流式细胞术发现,4PBA预处理明显降低细胞凋亡率。再进一步用CHOP-si RNA干扰胃癌细胞CHOP基因,然后加入病毒24h后检测自噬及凋亡蛋白表达情况,发现自噬及凋亡蛋白明显降低。充分证明r L-RVG诱导内质网应激介导自噬及凋亡的发生。6.r L-RVG感染胃癌细胞诱导的内质网应激通过IRE1/JNK/beclin-1通路调控细胞自噬r L-RVG和NDV分别感染胃癌细胞后,细胞内JNK蛋白磷酸化水平明显提高,而总JNK未见明显变化,beclin-1蛋白表达提高明显。使用特殊的JNK抑制剂(SP60015)预处理2 h后感染病毒,24后检测自噬及凋亡蛋白表达情况,发现自噬及凋亡蛋白表达下降。实验充分证明r L-RVG感染胃癌细胞诱导的内质网应激通过IRE1/JNK/beclin-1通路调控细胞自噬。7.r L-RVG感染胃癌细胞自噬调节内质网应激介导的凋亡使用自噬抑制剂3MA预处理12小时后,用病毒感染胃癌细胞24小时,Western Blot实验方法检测细胞内质网应激、自噬及凋亡蛋白的表达情况,发现内质网应激、凋亡相关蛋白表达明显降低。表明自噬在内质网介导的凋亡中扮演重要角色。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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