肝癌HepG2细胞TAB182基因沉默稳定细胞系的建立及其化疗敏感性的研究

发布时间：2017-12-30 00:22

本文关键词：肝癌HepG2细胞TAB182基因沉默稳定细胞系的建立及其化疗敏感性的研究　出处：《河北医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是一种恶性程度高、治愈率低的临床常见恶性肿瘤,居全球恶性肿瘤发病率的第六位,病死率的第三位。目前治疗肝癌的手段包括多种,如手术、放疗、化疗、分子靶向疗法、肝动脉化疗栓塞以及中医治疗等。化学治疗仍是治疗中晚期肝癌的重要手段。虽然不断有新的化疗药物和化疗方案推出,但是由于化疗耐药基因存在,使得化疗药物的疗效存在很大的局限性,进而导致癌症的复发与转移。近年来,随着分子生物学理论和基因重组技术的成熟,有关肝癌耐药基因的研究层出不穷,化疗联合基因治疗显示出广阔的应用前景。TAB182,又称TNKS1BP1,是在通过酵母双杂交试验研究与多聚ADP核糖聚合酶家族成员TNKS1的相互作用蛋白中首次被发现的。本实验室前期在大规模识别鉴定DNA双链断裂信号响应与修复的关键调节分子DNA-PKcs的磷酸化底物中发现:TAB182可能参与电离辐射诱发DNA损伤应激与信号响应的调控,进一步研究发现TABl82基因沉默的细胞放射敏感性增加;TAB182能够调节DNA双链断裂活化非同源末端连接信号通路,并且参与细胞周期进程的调节。DNA或DNA代谢过程会因放射线及多种抗癌药物的作用而受到直接或间接的影响,DNA受损后继发DNA损伤修复,而对DNA的修复结果就是使细胞生存率提高,基于这一原理,只要对DNA损伤修复过程加以抑制,就可以使细胞化疗敏感性提高。顺铂是肝癌临床治疗中常见化疗药物。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物,除了具有胰岛素增敏、降糖等作用,流行病学发现,二甲双胍可以降低糖尿病患者罹患肝癌的风险,并改善肝癌的预后。近期多项细胞、动物实验均提示二甲双胍可抑制肝癌的增殖和浸润转移,可能与促进细胞凋亡与周期阻滞和减少DNA损伤有关,但其具体机制还需进一步深入探讨。基于此,笔者设想,TAB182基因参与DNA损伤修复,增加肿瘤细胞放疗敏感性,那么,沉默TAB182是否可以提高作用于DNA的化疗药物肿瘤杀伤效果?为此,本研究以脂质体为载体,转染肝癌HepG2细胞,通过sh RNA技术调控TAB182的表达,筛选出TAB182蛋白稳定沉默的细胞,采用Cell Counting Kits-8(CCK-8)方法研究HepG2细胞TAB182基因沉默后对肝癌相关化疗药物敏感性的影响,为进一步探索筛选肝癌的靶向基因治疗提供依据。方法:1本课题选择离体肝癌HepG2细胞作为研究对象,利用脂质体2000介导基因转染的技术转染HepG2细胞,建立TAB182基因沉默细胞模型,通过潮霉素B筛选,建立TAB182基因沉默的单克隆HepG2细胞系,即HepG2-sh-TAB182细胞系。HepG2-NC作为阴性对照,也就是把和人类编码基因不存在同源性的载体或片段与转染细胞相连接。2通过Western blot的方法检测HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞TAB182蛋白表达情况。3通过CCK-8实验检测不同浓度顺铂(1、2、4、8μg/m L)、二甲双胍(5、10、20、40 mmol/L)在不同作用时间(24h、48h和72h)下对HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC细胞增殖抑制作用的差异与特征规律,并绘制相应的作用曲线。4采用统计学软件SPSS17.0进行实验数据分析,实验结果用均数±标准差表示。两独立样本采用t检验,P0.05视为有统计学差异。结果:1经Western blot技术检测显示:转染TAB182基因沉默sh RNA质粒的肝癌HepG2细胞,TAB182蛋白不表达,TAB182基因沉默稳定细胞系成功建立。2 CCK-8增殖实验表明:1)顺铂、二甲双胍作用于HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞,随着药物浓度增加及作用时间的延长,各组HepG2细胞增值抑制率逐渐增高,差距具有统计学意义(P0.05);2)给予顺铂、二甲双胍处理,在相同作用浓度及作用时间下,HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC相比,细胞增殖抑制率显著增高,差距具有统计学意义(P0.05)。结论:1本研究成功构建了肝癌HepG2细胞TAB182基因沉默稳定细胞系(HepG2-sh-TAB182细胞系)。2抑制TAB182基因表达能增加肝癌HepG2细胞对顺铂的药物敏感性,其机制有待进一步研究;3二甲双胍具有抑制肝癌HepG2细胞增殖作用,抑制TAB182基因表达能增加肝癌细胞对二甲双胍的药物敏感性,其机制有待进一步研究。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【参考文献】