DRAM1介导肺癌A549细胞的上皮间质转化作用及其机制研究

发布时间：2017-12-30 05:28

  本文关键词：DRAM1介导肺癌A549细胞的上皮间质转化作用及其机制研究　出处：《川北医学院》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景:肺癌的发病率和死亡率在全球各种恶性肿瘤中位居榜首。肺癌患者治疗失败的主要原因是发生侵袭转移,如何抑制肺癌的侵袭转移是目前肺癌治疗亟待解决的问题。研究发现上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)现象在上皮源性肿瘤细胞中普遍存在,其重要特征就是肿瘤细胞的细胞膜E-cadherin、β-catenin等上皮标记表达下调,获得间质细胞表型,表达vimentin,细胞黏附能力减弱,迁移和侵袭能力增强。因此,探讨EMT及其信号途径在肺癌中的分子机制和逆转策略具有重要的科学意义和临床应用前景。自噬(autophagy)是一种进化上保守的、维持细胞稳态的重要机制。其主要是通过形成双层膜结构,将细胞内需要被降解的蛋白或受损细胞器包裹起来,转运至溶酶体进行降解,之后将降解产物被用作细胞生物合成和细胞器的更新,从而维持细胞的稳定。目前研究表明,自噬的激活与肿瘤的发生、发展有着密切的关系,通过调控自噬水平,可以影响肿瘤的增殖、凋亡、侵袭。因此,自噬成为肿瘤研究领域的热点。损伤相关自噬调节因子(Damage-Regulated Autophagy Modulator,DRAM)是一类高度保守的基因,其公认的作用是通过诱导自噬溶酶体的聚集,从而激活细胞自噬。DRAM家族中目前发现了5个基因,其中DRAM1是目前DRAM家族中最受关注的基因。既往研究表明DRAM1在肺癌等多种肿瘤组织呈低表达,其主要功能是调控自噬,诱导p53和p73依赖的自噬性凋亡。目前研究表明,调节自噬相关基因p62/sqstm1可影响肿瘤细胞的emt。此外,tgf-β1在诱导肿瘤细胞emt的同时,也影响了细胞内的自噬流。上述结果提示自噬和emt直接关系密切。那么,作为自噬调节基因的dram1,是否可以通过调控p62/sqstm1进而影响肺癌细胞emt的作用呢?基于上述科学设想,本研究拟通过调控dram1表达,探讨其对肺癌a549细胞自噬和emt的影响,以及其在tgf-β1诱导的emt中发挥作用和机制,初步阐述dram1在调控肺癌a549细胞emt中的作用和潜在的机制。实验结果有望为肺癌侵袭和迁移的防治提供新的思路和潜在的治疗靶标。研究目的:1.明确dram1在调节a549细胞emt中的作用;2.探讨dram1调节a549细胞emt的潜在机制。研究方法:1.培养a549细胞,应用实时定量pcr检测1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mltgf-β1分别处理24h和5ng/mltgf-β1分别处理12、24和48h后,a549细胞中内源性dram1的表达情况;2.提取过表达质粒pegfp-n1-dram1(dram1)和空载体pegfp-n1(vector)质粒,并转染a549细胞。应用免疫荧光显微镜观察转染效率,利用应用实时定量pcr和westernblot检测转染质粒后,dram1、e-cadherin、vimentin、atg5、p62、twist以及lc3b的表达;3.应用划痕实验和transwell小室,检测转染dram1质粒后对a549细胞迁移能力的影响;4.5ng/mltgf-β1处理a549细胞24h后,利用实时定量pcr检测atg5、p62和twistmrna的表达变化,并用westernblot检测atg5、p62、twist以及lc3b蛋白的表达;5.转染dram1sirna和sirna阴性对照(negativecontrol,nc)后,再用5ng/mltgf-β1处理a549细胞24h后,利用实时定量pcr和westernblot检测e-cadherin、vimentin、p62和twist的表达;研究结果:1.用1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mltgf-β1分别处理a549细胞后,dram1mrna的表达显著高于未处理组(contorl,ctl)(p0.05);随着重组人tgf-β1浓度逐渐升高(从1ng/ml到5ng/ml),dram1的表达也随之升高(p0.05);5ng/ml组与10ng/ml组的dram1mrna的表达水平无显著差异(p0.05)。应用5ng/ml的tgf-β1分别处理a549细胞12、24h、48h后,发现dram1mrna的相对表达水平随着时间的延长而增加(p0.05),呈时间依赖性。2.我们成功扩增和提取空载体pegfp-n1(vector)质粒和pegfp-n1-dram1质粒。将上述两种质粒分别转染a549细胞48h后,使用荧光显微镜观察到两种质粒均成功转染进入a549细胞。pegfp-n1-dram1质粒转染a549细胞后,dram1、vimentin、atg5、p62、twist和lc3bii/i表达显著高于未转染质粒对照组和vector组(p0.05)。3.发现转染pegfp-n1-dram1质粒后,a549细胞的迁移的能力较未转染质粒对照组和vector组显著增强。4.使用5ng/ml重组人tgf-β1处理a549细胞24h后,qpcr检测显示atg5、p62和twistmrna表达水平较对照组显著升高(p0.05);western blot检测发现,自噬相关蛋白LC3B、Atg5、p62以及Twist表达水平较对照组显著升高(p0.05)。5.Twist、p62以及vimentin mRNA和蛋白表达在TGF-β1+NC组、TGF-β1+DRAM1 siRNA组较未转染siRNA对照组显著增高(p0.05),并且Twist、p62以及vimentin mRNA和蛋白表达在TGF-β1+NC组的水平高于TGF-β1+DRAM1 siRNA组(p0.05)。相反地,E-cadherin mRNA和蛋白表达在TGF-β1+NC组、TGF-β1+DRAM1siRNA组较未转染siRNA对照组显著增高(p0.05),而TGF-β1+NC组中的E-cadherin mRNA表达显著低于TGF-β1+DRAM1 siRNA组(p0.05)。结论:1.DRAM1参与了TGF-β1介导的细胞自噬和EMT过程2.DRAM1可调控细胞的自噬水平和EMT3.p62-twist作为自噬和EMT的连接桥梁,可能在DRAM1调控EMT中发挥一定的作用,具体机制仍需进一步研究
[Abstract]:......
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：1353553