RNA沉默HIF-1α对NB4急性早幼粒细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-01-03 05:29

本文关键词：RNA沉默HIF-1α对NB4急性早幼粒细胞生物学行为的影响　出处：《浙江大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：研究低氧状态HIF-1α基因干扰对NB4急性早幼粒细胞的增殖、侵润和分化等生物学行为影响,探索HIF-1α对急性早幼粒白血病细胞分化的相关机制。方法：设计及合成HIF-1α特异性siRNA,构建HIF-1α siRNA重组慢病毒和阴性对照组慢病毒,通过感染筛选出最佳慢病毒载体。CoCl2模拟缺氧微环境,检测不同浓度梯度对NB4细胞增殖的影响,选择最利于NB4细胞生长的CoCl2浓度,作为模拟缺氧微环境的终浓度。利用最佳慢病毒载体干扰NB4细胞中HIF-1α的表达,RT-PCR检测HIF-1α的mRNA表达水平和Western blot检测细胞内HIF-1α蛋白、VEGF蛋白、SDF-1蛋白的干扰效果,用新型四唑单钠盐试剂盒(CCK-8)检测实验组和对照组的细胞存活率,用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒检测HIF-1α干扰下实验组和对照组细胞凋亡水平变化,使用流式细胞术检测实验组和对照组细胞CDllb的表达以分析NB4的成熟分化程度,探索HIF-1α对急性早幼粒白血病细胞分化的相关机制。结果：1、模拟缺氧微环境,CoCl2终浓度在100μmol/L时,细胞增殖效率、HIF-1αRNA表达水平显著性高于常氧条件培养NB4细胞(P0.05),对NB4细胞影响作用最强。2、MOI为25、50、75时,GFP表达率均值为50.6%、75.3%、98.2%,三组MOI存在显著性差异(P0.01),因此选择MOI为75是较合理的选择。3、流式细胞术检测感染细胞上GFP表达强度,评估慢病毒干扰细胞株NB4转染效率,与阴性慢病毒比较,慢病毒4对于NB4细胞的荧光感染效率最低(P0.01),慢病毒1、慢病毒2、慢病毒3感染效率很高且彼此间无显著性差异(P0.05); RT-PCR检测各组感染细胞中HIF-1α RNA表达情况,与阴性对照相比,慢病毒2感染NB4细胞HIF-1α表达率最低(P0.01),慢病毒2载体干扰NB4细胞可作为实验组。4、与阴性对照组相比,实验组细胞增殖率、HIF-1α mRNA抑制率均下降,有显著性差异(P0.01)；HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白表达下降(P0.05)；实验组细胞凋亡率、细胞侵袭、细胞分化、迁移有显著性差异(P0.01)。细胞形态学显示,实验组细胞的凋亡和死亡的细胞数量增加明显(P0.01)结论：通过研究发现HIF-1α基因调节HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白来实现细胞生物活性,对NB4的增殖起重要作用；RNA沉默HIF-1α基因,在缺氧状态,HIF-1α RNA基因表达下降,HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白均下调,实验细胞的增殖能力受到明显抑制,细胞凋亡率大大增加,成熟分化比例显著增加。同时发现利用CDllb可作为评估早幼粒白血病细胞向成熟分化的检测指标。本研究利用基因干扰技术,下调缺氧诱导信号通路中目的基因和相关蛋白质的表达,为治疗急性早幼粒白血病拓展一种新的基因靶点,从基因和蛋白质水平科学评估APL疗效,是对APL治疗新方法的积极探索。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7

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