重金属锑通过上调CtBP2表达促进前列腺癌进展机制
本文关键词：重金属锑通过上调CtBP2表达促进前列腺癌进展机制 出处：《天津医科大学》2016年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：目的明确低剂量重金属锑暴露后,对前列腺癌进展产生的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT方法筛选锑暴露PC3细胞的亚致死剂量,并明确在该剂量下锑对PC3细胞增殖效应的影响;明确锑暴露影响细胞增殖最显著剂量后,用该剂量锑处理PC3细胞,分别通过细胞划痕实验、Transwell实验以及磷脂酰丝氨酸外翻法分析,研究锑暴露对细胞迁移能力、侵袭能力及凋亡能力的作用;采用基因转录组测序的方法,研究低剂量锑暴露PC3细胞后,基因异常表达情况;根据基因测序结果,分别采用RT-qPCR及Western Blot方法,研究低剂量锑暴露对CtBP2以及下游蛋白转录翻译水平的影响;通过比对CtBP2转录起始上游DNA序列,查询金属效应元件(MRE)结构,构建MRE表达质粒后转染HEK293T细胞,予以低剂量锑暴露后,进行双荧光素酶报告基因实验,证明MRE结构与低剂量锑暴露的关系;建立锑暴露裸鼠荷瘤实验模型后,明确低剂量锑对裸鼠及皮下肿瘤生长的影响,并记录裸鼠体重及皮下种植瘤体积变化,绘制生长曲线,采用Western Blot方法检测其肿瘤组织中CtBP2以及下游蛋白表达水平。结果低剂量锑暴露可促进PC3细胞增殖,并发现在锑暴露剂量为8uM时,其促进增殖效应最为显著(P0.05);以8uM锑暴露PC3细胞后,细胞迁移以及侵袭能力均显著增加(P0.05),但并不能增加其抗凋亡能力;根据基因转录组测序结果,低剂量锑暴露PC3细胞后,多种基因出现显著的差异性表达,其中包括CtBP2表达水平显著增加(P0.05);根据RT-qPCR方法验证,低剂量锑暴露后PC3细胞中CtBP2 mRNA显著增加,结合Western Blot实验结果提示,CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111蛋白表达水平显著增高(P0.05);通过比对CtBP2 DNA序列,证明其转录起始上游具有金属效应元件(MRE)结构,因此CtBP2为MRE调控的效应基因;成功构建金属效应元件表达质粒后,双荧光素酶报告基因系统结果证明,低剂量锑可以与该结构发生相互作用,进一步促进下游CtBP2表达增加;建立低剂量锑暴露裸鼠荷瘤实验模型后,对照组与10mg/kg/d组裸鼠皮下种植瘤体积分别为(1344.9±882.8)mm3以及(2612.4±777.5)mm3,具有统计学差异(P0.05),结果证实低剂量锑可显著促进裸鼠种植瘤生长;而通过Western Blot实验证明在低剂量锑暴露后的裸鼠肿瘤组织中,CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111蛋白表达水平显著升高(P0.05)。结论低剂量锑暴露可显著影响前列腺癌细胞的生物学行为,促进前列腺癌进展。该作用机制是低剂量锑与金属效应元件(MRE)相互作用上调CtBP2表达,并通过调节CtBP2-c-Myc信号通路,发挥其促进肿瘤进展的作用。
[Abstract]:Objective to make clear the low dose of heavy metal antimony exposure after impact on the progression of prostate cancer, and to explore its mechanism. Methods MTT method for screening antimony exposure of PC3 cells to sublethal dose, and clarify the influence in the dose effect of antimony on the proliferation of PC3 cells; clear cell proliferation is the most significant effect of antimony exposure dose, with the dose of antimony PC3 cells were treated respectively by cell scratch test, Transwell test and analysis of phosphatidylserine method of antimony exposure on cell migration, invasion and apoptosis ability; using the base method for transcriptome sequencing, the study of low dose of antimony exposed PC3 cells, abnormal expression of genes according to the situation; the sequencing results, using RT-qPCR and Western Blot respectively, the study of low dose exposure to CtBP2 and the downstream effects of antimony protein transcription and translation level of CtBP2 transcription by ratio; Only the upstream DNA sequence query metal response element (MRE) structure, construction of MRE expression plasmid was transfected into HEK293T cells to low dose of antimony after exposure by dual luciferase reporter assay, prove the relationship between MRE structure and low dose exposure to antimony; antimony exposure to establish nude mice model, a clear effect of low dose of antimony growth and in nude mice subcutaneous tumor in nude mice, and record the weight and subcutaneous tumor volume changes, growth curve, the expression of CtBP2 and its downstream protein level in tumor tissue by Western Blot method. The results of low dose exposure to antimony can promote the proliferation of PC3 cells, and found that the antimony exposure dose was 8uM, the proliferation effect of the significant (P0.05); 8uM antimony exposed PC3 cells, cell migration and invasion were significantly increased (P0.05), but did not increase the ability of anti apoptosis; according to gene transcriptome sequencing results, Low dose of antimony exposed PC3 cells, a variety of gene differential expression significantly, including the expression level of CtBP2 increased significantly (P0.05); according to the method of RT-qPCR CtBP2 verification, PC3 cells mRNA increased significantly after exposure to low doses of antimony, combined with the Western Blot results suggest that CtBP2 and c-Myc downstream, the expression level of HSPC111 protein increased significantly (P0.05); by comparing the CtBP2 DNA sequence, prove its upstream transcription start with metal response element (MRE) structure, so the effect of CtBP2 MRE gene; metal element expression plasmid was constructed successfully after the dual luciferase reporter assay results show that low dose of antimony can interact with the structure, to further promote the downstream the expression of CtBP2 increased; establishment of low dose exposure to antimony nude mice model, the control group and 10mg/kg/d group in nude mice tumor is integral (1344.9 + 882.8) mm 3 and (2612.4 + 777.5) mm3, with statistical difference (P0.05). The results confirmed that low dose of antimony can significantly promote the growth of nude mice; and demonstrated in the tumor tissue of mice after exposure to low doses of antimony by Western Blot experiment, CtBP2 and downstream c-Myc, HSPC111 protein expression increased significantly (P0.05). Low dose exposure to antimony can significantly affect the biological behavior of prostate cancer cells, promote the progression of prostate cancer. The mechanism of low-dose and antimony metal response element (MRE) interactions upregulate the expression of CtBP2, and by regulating the CtBP2-c-Myc signaling pathway, play its role in tumor progression.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
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，本文编号：1401712
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