串联亲和纯化技术联合质谱鉴定RSK4变异体的相互作用蛋白

发布时间：2018-01-25 17:26

  本文关键词： RSK4 变异体 乳腺癌 相互作用蛋白 串联亲和纯化 CCK-8　出处：《广西医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的：乳腺癌,一个人们闻之色变的名词,根据最新的统计数据,在中国每年的新诊断出的乳腺癌病例及死亡病例分别占全球的12.2%和9.6%[1],这一数值的持续升高,加速着我们对乳腺癌研究的不断深入。Berns[2]及SUN Y[3]等人先后证明了,RSK4 (p90核糖体蛋白S6激酶4,P90 Ribosomal S6 kinase 4)是抑制乳腺癌侵袭转移的重要因子,它能够抑制乳腺癌细胞的生长并诱导其衰老,但对于其通过mRNA可变剪接作用下行成的RSK4的变异体(RSK4 variants, RSK4m)我们却知之甚少。由于RSK4的第19外显子发生15个碱基的缺失突变(-15nt)和第21外显子的缺失突变(-E21),造成其自由组合形成了三种变异体①缺少倒数第二个外显子,即+15nt-E21(变异体1)；②缺少第19个外显子的前15个碱基,即-15nt+E21(变异体2)；③缺少第19个外显子的前15个碱基和倒数第二个外显子,即-15nt-E21(变异体3)。我们这篇文章针对的是新发现的RSK4变异体,对它们的研究尚处于起步阶段,特别是其与野生型RSK4的功能差异,是相同还是截然相反,我们都不了解,如果丢失了抑制功能,那是否可以作为新的靶向治疗标记,若是能力相同同为抑制,那是具有一样的机制导致的还是有着不同的作用机理,哪种更容易调控对肿瘤细胞的侵袭转移的影响。本研究旨在寻找RSK4m的相互作用蛋白,以便于为后续研究其分子机制及在乳腺癌中的功能做铺垫。研究方法：分别构建带有两个Strep-Ⅱ标签和一个flag标签[4](串联亲和纯化标签)的RSK4变异体2(RSK4m2)和RSK4变异体3 (RSK4m3)的过表达慢病毒,稳定转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,使用蛋白印迹实验(Western Blot)与实时荧光定量PCR (Real-time fluorogenic quantitatice PCR)检测变异体的蛋白及mRNA的表达情况,通过串联亲和纯化蛋白后进行质谱鉴定,再通过生物信息学分析找出互作蛋白,然后通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, CO-IP)从结果中挑选出的热休克蛋白HSP90aa1与RSK4m2的相互作用关系进行验证[5]。最后用CCK-8试剂盒检测转染后乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长增殖情况[6]。研究结果：本研究通过以两个Strep II标签和一个FLAG标签为基础的串联亲和纯化技术(SF-TAP)联合nano LC-MS/MS质谱技术分别分离和鉴定出452个与RSK4m2相关的蛋白,713个RSK4m3相关的蛋白。GO分析结果：RSK4m2或RSK4m3的互作蛋白参与细胞的多种生理活动,IPA分析结果：得到RSK4m2和RSK4m3的富集度最高的蛋白互作网络,其中RSK4m2与HSP90aa1存在着直接相互作用关系。结果表明两种变异体参与了多种细胞活动,并拥有多种不同的生物学功能。同时,CO-IP证实了HSP90aa1与RSK4m2存在相互作用关系。CCK-8结果显示过表达RSK4m2组、过表达RSK4m3组在24、48、72、96h的细胞抑制率(%)分别达到了3.9±0.01、5.6±0.01、31.1±0.01、23.6±0.02；1.5±0、4.4±0.03、22.1±0.05、19.7+0.02,在48、72、96h的差异具有统计学意义(P0.05)。研究结论：RSK4m2和RSK4m3可更强地抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖,结果表明RSK4m可能有抑制乳腺癌细胞增殖的功能,但可能与RSK4野生型(RSK4w)存在着不同的调控机制,RSK4m可能比RSK4w拥有更多的生物功能,RSKm2可能是通过抑制HSP90aa1来阻碍癌细胞的生长,但其中的具体功能尚有待更深入的研究。
[Abstract]:Objective: breast cancer, a dreaded noun, according to the latest statistics, in the case of new year's China diagnosis of breast cancer cases and deaths accounted for 12.2% of global 9.6%[1], this figure continues to rise, speeding up our in-depth research on breast cancer.Berns[2] and SUN Y[3] et al have demonstrated that RSK4 (P90 ribosomal protein S6 kinase 4, P90 Ribosomal S6 kinase 4) is an important factor to inhibit the invasion and metastasis of breast cancer, it can inhibit the growth of breast cancer cells and induce senescence, but the effect by mRNA splicing variants of RSK4 into the downlink (RSK4 variants RSK4m) we don't know much about it. Due to the lack of RSK4 exon nineteenth mutation occurred in 15 (-15nt) deletion and exon twenty-first mutation (-E21), the free combination of the formation of three body bottom second lack of variation Exons, namely +15nt-E21 (variant 1); the lack of 15 bases before the nineteenth exon, namely -15nt+E21 (variant 2); the lack of the nineteenth exon 15 bases before and last second exons, namely -15nt-E21 (Variant 3). In this article we the newly discovered RSK4 variants, their research is still in its infancy, especially with the wild type RSK4 functional differences, is the same or opposite, we do not understand, if you lose the inhibition function, whether it can be used as new targeted marker, if can force the same restraint, that is the same mechanism to cause or have different mechanisms, which are more likely to affect regulation of tumor cell invasion and metastasis. The purpose of this study is to search for proteins interacting with RSK4m, so as to further research the molecular mechanism and function in breast cancer. 2. Research methods: were constructed with two Strep- tag and a flag tag [4] (tandem affinity purification tag) RSK4 variant 2 (RSK4m2) and RSK4 (RSK4m3) variant 3 overexpression of lentivirus stably transfected into MDA-MB-231 cells, using Western blot (Western Blot) and real time fluorescence quantitative PCR (Real-time fluorogenic quantitatice PCR) to detect the expression of protein and mRNA variants, were identified by tandem affinity purification of protein, and then find out the interaction protein through the bioinformatics analysis, and then by CO immunoprecipitation (Co-Immunoprecipitation, CO-IP) to verify the interaction between [5]. selected from the results of heat shock protein HSP90aa1 and RSK4m2 finally detected by CCK-8 after transfection of MDA-MB-231 breast cancer cells growth and proliferation of [6]. findings: this research by Tandem affinity purification of two Strep II tag and a FLAG tag based (SF-TAP) combined with nano LC-MS/MS mass spectrometry were isolated and identified 452 proteins associated with RSK4m2, 713 RSK4m3 related protein.GO analysis results: the interaction of many physiological activities of protein involved in cell RSK4m2 or RSK4m3, IPA results: RSK4m2 and RSK4m3 accumulation in the highest degree of protein interaction networks, including RSK4m2 and HSP90aa1 there is a direct interaction. The results show that two kinds of variants involved in various cellular activities, and has a variety of biological functions. At the same time, CO-IP confirmed that HSP90aa1 interacted with RSK4m2.CCK-8 results over expression of RSK4m2 group. The expression inhibition rate of RSK4m3 group in 24,48,72,96h cells (%) respectively, 3.9 + 0.01,5.6 + 0.01,31.1 + 0.01,23.6 + 0.02; 1.5 + 0,4.4 + 0.03,22.1 + 0.05, 19.7+0.02, with statistically significant differences in 48,72,96h (P0.05). Conclusion: RSK4m2 and RSK4m3 can be stronger inhibition of breast cancer cell line MDA-MB-231 proliferation, the results showed that RSK4m could inhibit the proliferation of breast cancer cells, but may be related to the wild type RSK4 (RSK4w) has a different mechanism, RSK4m may have more the biological function of RSK4w, RSKm2 may be through inhibition of HSP90aa1 to prevent the growth of cancer cells, but the specific function which needs to be more in-depth research.

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：1463301