MGST1抑制肺腺癌细胞的凋亡及其机制研究

发布时间：2018-01-28 09:25

  本文关键词： 肺腺癌 MGST1 细胞凋亡 caspase　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率在我国及全世界均高居首位。肺腺癌是肺癌最常见的组织类型之一,发现时常处于晚期,预后较差。近年虽在分子机制研究上取得较大进展,但其发病机制远未阐明。因此研究肺腺癌的致病驱动基因,探寻肺腺癌新的治疗靶基因具有重大意义。研究表明,MGST1与食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤发生发展过程密切相关,且在转基因小鼠肺癌中高表达,但其在肺癌中所发挥的功能和作用机制研究尚未见报道。我们前期研究发现MGST1在人肺腺癌组织标本中高表达,抑制肺腺癌细胞A549中MGST1的表达后,可抑制细胞增殖活性,促进细胞凋亡的发生,但机制尚未阐明。因此,阐明MGST1促进肺腺癌凋亡的作用机制有待进一步研究,MGST1有望成为肺腺癌新候选治疗靶基因。研究目的:本实验运用慢病毒干扰肺腺癌细胞系PC-9内源性MGST1的表达和过表达质粒转染肺腺癌细胞系SPC-A-1增加外源性MGST1的表达,从正反两方面初步研究MGST1在肺腺癌细胞中发挥的生物学功能,并进行机制探讨,旨在获得MGST1在肺腺癌恶性进程中发挥重要作用的可靠实验证据,为MGST1成为肺腺癌新候选治疗靶基因提供科学依据。研究方法:本实验运用Western-blot检测肺上皮细胞系BEAS-2B及肺腺癌细胞系SPC-A-1、H2342、A549、H1975、PC-9、XLA-07 中 MGST1 蛋白的基础表达水平,并选择PC-9及SPC-A-1作为后期研究的工具细胞;运用慢病毒感染肺腺癌PC-9细胞,干扰内源性MGST1的表达,Western-blot验证干扰效果、MTS检测增殖活性、克隆形成实验检测克隆形成能力、流式细胞仪检测细胞凋亡、Western-blot检测相关凋亡蛋白变化;运用构建重组质粒和转染筛选稳定过表达基因细胞系的方法,建立稳定过表达 MGST1 的 SPC-A-1 细胞系,Real-time QPCR 检测 MGST1 mRNA 的表达水平、Western-blot检测MGST1蛋白的表达水平、MTS检测增殖活性、克隆形成实验检测克隆形成能力、流式细胞仪检测H2O2诱导细胞凋亡、Western-blot检测相关凋亡蛋白变化。研究结果:1.MGST1蛋白在肺上皮细胞系及肺腺癌细胞系中的表达情况●Western-blot结果显示:MGST1蛋白在肺腺癌细胞中的表达水平均比肺上皮细胞BEAS-2B高,且以H1975、PC-9、XLA-07细胞表达相对较高,SPC-A-1、H2342、A549细胞表达相对较低。根据基础表达情况,后期选择PC-9作为慢病毒干扰MGST1的细胞系,SPC-A-1作为构建稳定过表达MGST1的细胞系。2.慢病毒干扰PC-9细胞MGST1的表达后,促进PC-9细胞凋亡● MGST1干扰慢病毒感染PC-9细胞后,Western-blot结果显示:MGST1蛋白表达显著减少,表明感染慢病毒成功发挥干扰蛋白表达的作用;● MTS结果显示:干扰MGST1的表达后,PC-9细胞增殖活性受到明显抑制;●克隆形成实验结果显示:干扰MGST1的表达后,PC-9细胞克隆形成能力明显被抑制;●流式细胞仪检测凋亡结果显示:干扰MGST1的表达后,PC-9细胞凋亡显著增加;●Western-blot检测凋亡相关蛋白结果显示:干扰PC-9细胞的MGST1表达后,凋亡蛋白 caspase 9、caspase 3、PARP 表达降低,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP 表达明显升高。3.SPC-A-1细胞过表达MGST1基因后,抑制H2O2诱导SPC-A-1细胞的凋亡●测序鉴定MGST1过表达质粒构建成功,Real-time QPCR和Western-blot结果验证MGST1在稳转细胞系SPC-A-1中转录和蛋白水平表达均升高,表明稳定过表达MGST1的SPC-A-1细胞系成功建立;● MTS结果显示:稳定过表达MGST1基因后,SPC-A-1细胞的增殖活性明显增加;●克隆形成实验结果显示:稳定过表达MGST1基因后,SPC-A-1细胞克隆形成能力明显增强;●流式细胞仪检测凋亡结果显示:稳定过表达MGST1基因后,H202诱导的SPC-A-1细胞凋亡显著减少;●Western-blot检测凋亡相关蛋白结果显示:稳定过表达SPC-A-1细胞MGST1基因后,H2O2诱导的SPC-A-1细胞凋亡蛋白caspase 9、caspase 3、PARP表达增多,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP 表达明显减少。结论:通过本实验研究发现,MGST1可通过抑制caspase凋亡蛋白9、3、PARP发挥抑制肺腺癌细胞凋亡的作用。
[Abstract]:Objective : To study the mechanism of MGST1 expression in lung adenocarcinoma cell line SPC - A - 1 銆，

本文编号：1470382