异硫氰酸盐促进阿霉素诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

发布时间：2018-01-29 13:08

本文关键词： 异硫酸盐促进霉素诱导人骨肉瘤细胞凋亡实验研究　出处：《广西医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：本文旨在探讨异硫氰酸盐与阿霉素在体外联合作用人骨肉瘤细胞(U2-OS)后对细胞凋亡的影响,证明异硫氰酸盐能促进阿霉素诱导U2-OS细胞凋亡,并讨论其可能的作用机制,为骨肉瘤的临床治疗提供一定的参考。方法：将冻存的U2-OS细胞复苏培养后镜下观察拍照,了解细胞活性,并选取第二代生长良好的U2-OS细胞作为实验对象；分别以lug/ml、 2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml浓度的阿霉素和2uM/ml,4uM/ml,8uM/ml,16uM/ml,32uM/ml,64uM/ml浓度的异硫氰酸盐单独作用于呈对数期生长的U2-OS细胞,检测药物对细胞增殖抑制率的影响,计算IC50的数值；然后将lug/ml、3ug/ml、10ug/ml的阿霉素分别与2uM/ml、 2.5uM/ml、4uM/ml、的异硫氰酸盐联合作用于U2-OS细胞24h后,MTT法进行细胞抑制率的测算,并绘制抑制率与浓度直方图,计算Q值来评估两药联合作用的效应,得到最佳的药物作用浓度；根据最佳作用浓度,随机将细胞分为空白组、阿霉素组、异硫氰酸盐组及联合用药组四组,作用24小时后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较各组细胞凋亡率的变化情况；同样根据最佳作用浓度,以相同的分组方法检测caspase3因子的活性情况及用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡,比较各组细胞凋亡率的变化情况,并与流式细胞仪结果比较看变化的趋势是否一致；在作用机制的探讨中我们先选用AAH-APO-1芯片(细胞凋亡抗体芯片)来检测相关的凋亡因子,随机将培养好的细胞分为4组,分别为空白组、阿霉素组、异硫氰酸盐组及联合用药组,药物作用24小时后用芯片检测约40种较常见的细胞凋亡因子,选取其中变化最大的因子作为我们下一步的研究对象,并了解他们之间的关系；Real time PCR法检测四组细胞中Caspase3、caspase9、Bc1-2及Bax的mRNA表达量,对比各组的结果；Western blotting检测四组细胞中Caspase3、caspase9、Bcl-2及Bax蛋白表达量,比较各组之间的结果,并与细胞凋亡抗体芯片及Real time PCR的结果比较看因子的变化趋势是否一致。结果：复苏后的细胞按常规方法培养,二代细胞可在48小时之内贴壁,细胞生长迅速,排列紧密,活性良好,可作为实验对象；MTT法检测可知阿霉素和异硫氰酸盐药物浓度的增大,肿瘤细胞抑制率随之增高,阿霉素IC50=10.322ug/ml,异硫氰酸盐的IC50=5.33uM/L;两药联合作用后MTT检测阿霉素3ug/ml与异硫氰酸盐2.5uM/ml配对时U2-OS细胞的抑制率为70.482%,Q值1.886,表明两药协调作用最好,选择此浓度作为我们下一步研究的药物作用浓度；将培养好的U2-OS细胞随机分为4组,分别为空白组,阿霉素(3ug/ml)组、异硫氰酸盐(2.5uM/ml)组、阿霉素(3ug/ml)+异硫氰酸盐(2.5uM/ml)组,药物作用24小时后用流式细胞仪检测细胞凋亡率(我们以早期凋亡率的结果来比较),空白组凋亡率(%)3.2士0.6,阿霉素(3ug/ml)组凋亡率(%)8.5±2.3,异硫氰酸盐组凋亡率(%)9.2±3.1,阿霉素(3ug/ml)+异硫氰酸盐(2.5uM/ml)组组凋亡率(%)35.2±7.9,联合用药组与空白组和单独用药组比较(用SPSS16.0软件分析,n=10)细胞凋亡率有显著差异(p0.05),凋亡率明显增高；同样的分组方法,Caspase3活性检测结果联合用药组为42.86±10.376,较空白组5.48±2.153、阿霉素(3ug/ml)组13.62±4.874、异硫氰酸盐(2.5uM/ml)组10.56+4.162明显增高(p0.05,n=3),caspase3作为凋亡的终末执行因子,与细胞凋亡呈正相关,与流式细胞仪检测的结果基本一致；TUNEL染色法检测U2-OS细胞凋亡,空白组中的早期凋亡细胞非常少,阿霉素组凋亡率(%)为6.5±2.16,,异硫氰酸盐组凋亡率(%)为7.3±2.47,联合用药组凋亡率(%)为38.64±11.35,联合用药组与空白组和单独用药组比较(用SPSS 16.0软件分析,n=5)细胞凋亡率有显著差异(p0.01),凋亡率明显增高；AAH-APO-1芯片结果提示Caspase3、 caspase9及Bax联合用药组叫空白组及单独用药组显著增高,而Bcl-2联合用药组叫其他三组显著降低,另外与Bcl-2家族有密切关系的XIAP因子呈高表达,但联合用药组与其它三组比较变化不是十分明显；RT-PCR结果提示Caspase3、caspase9及Bax空白组表达量较低,而联合用药组显著增高,Bcl-2则相反,空白组呈高表达,联合用药组显著减少；Western blotting检测结果与RT-PCR结果基本相符,Caspase3、caspase9及Bax联合用药组显著增高,其中以Caspase3变化幅度最大,Bcl-2联合用药组较空白组显著降低。结论：1：异硫氰酸盐与阿霉素联合作用后对细胞增殖有协调作用。2：在体外较低的药物浓度下异硫氰酸盐能促进阿霉素诱导人骨肉瘤细胞U2-OS的凋亡作用。3：异硫氰酸盐联合阿霉素可能是通过调节Bcl-2家族凋亡因子来促进凋亡。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of isothiocyanates and adriamycin on the apoptosis of human osteosarcoma cells ( U2 - OS ) in vitro . The apoptosis rate ( % ) , apoptosis rate ( % ) of Caspase - 3 , caspase9 , Bcl - 2 and Bax in four groups of cells were detected by MTT assay . The results showed that the inhibition rates of Caspase - 3 , caspase9 , Bcl - 2 and Bax in four groups of cells were determined by MTT assay . The apoptosis rate ( % ) of caspase - 3 , caspase9 and Bax was significantly higher than that in blank group ( P < 0.01 ) .

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738.1

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