人原发性肝癌中共刺激分子B7-H4的表达及与免疫抑制相关机制的研究

发布时间：2018-01-30 04:38

本文关键词： 原发性肝癌 B7-H4 T淋巴细胞细胞因子自噬免疫抑制　出处：《暨南大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景及目的:原发性肝癌是世界范围内肿瘤高发病率和死亡率的主要因素,对人类的生命健康造成严重的威胁。原发性肝癌的治疗目前形成了手术切除为主,结合放化疗、生物治疗及辅助治疗的综合治疗模式。近年来,肿瘤免疫治疗也受到广泛关注。人体的肿瘤免疫应答机制中,由T细胞介导的细胞免疫是极其重要的机制。T细胞的活化和增殖依赖双重信号通路,T细胞受体通过结合抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)递呈MHC-抗原肽复合物活化幼稚T细胞,产生第一信号,而与T细胞受体结合的APC表面的多种共刺激分子参与提供共刺激信号即第二信号,第二信号若缺失或提供共抑制信号,将使T细胞克隆无能或使T细胞活化与功能受到抑制,导致免疫抑制和免疫逃逸。共刺激分子具有众多成员,主要由B7家族,TNF家族和细胞因子家族三大家族构成。作为B7家族中新发现的成员,共刺激分子B7-H4对T细胞免疫具有显著负性调节作用,更是当前免疫治疗研究热点。本实验探讨了在人原发性肝癌组织中,B7-H4表达上调的临床意义及与免疫环境中CD4+,CD8+T细胞浸润程度及功能性细胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌的相关性,初步探讨人肝癌组织中B7-H4表达上调诱导免疫抑制的机制;同时,采用Western Blot技术检测人肝癌及癌旁组织中纯化分离出CD8+T细胞中B7-H4,IFN-γ及自噬通路PI3K-AKT-m TOR-LC3I-LC3II中相关蛋白的表达情况。进一步探讨人肝癌组织中B7-H4表达上调与T细胞异常自噬产生相关性及诱导免疫抑制相关机制。方法:第一部分实验采用免疫荧光染色方法,检测80例手术切除的肝癌和癌旁组织,20例正常肝组织标本中B7-H4的表达情况,肝癌组织中浸润CD4+,CD8+T细胞及功能性细胞因子TGF-β1和IFN-γ的数量,Western Blot法检测新鲜肝癌及癌旁组织中B7-H4、TGF-β1和IFN-γ蛋白的表达,分析B7-H4表达上调的临床意义及与CD4+,CD8+T细胞浸润程度及TGF-β1、IFN-γ分泌的相关性。第二部分实验采用免疫磁珠分选的方法从同一来源的肝癌及癌旁组织中纯化分离出CD8+T细胞,利用Western Blot技术检测两组细胞中B7-H4、IFN-γ蛋白的表达及自噬通路PI3K-AKT-m TOR-LC3I-LC3II中相关蛋白的表达情况,探讨B7-H4表达上调与T细胞异常自噬产生及免疫抑制机制相关性。结果:(1)B7-H4在正常肝组织中几乎不表达,在癌旁组织中呈弱阳性表达,阳性表达率为48.0%。在肝癌组织中B7-H4阳性着色主要定位于胞膜及胞浆中,阳性表达率为81%,显著高于癌旁组织和正常肝组织(**P=0.000,***P=0.000)。同时,癌旁组织中B7-H4表达水平高于正常肝组织,差异具有统计学意义(*P=0.026)。肝癌组织中B7-H4表达水平与淋巴结转移、肿瘤浸润深度及TNM分期呈正相关关系(P=0.010,P=0.023,P=0.007),尤其与淋巴结转移及TNM分期显著相关(P=0.010,P=0.007),而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤细胞分化程度无相关性(P0.05)。(2)在80例人肝癌组织中,B7-H4阳性表达的病例有65例。其中,CD4+T细胞呈低度浸润有45例,低度浸润率达69.2%;CD8+T细胞呈低度浸润有52例,低度浸润率达80.0%。TGF-β1蛋白呈低度浸润有44例,低度浸润率达67.7%;IFN-γ蛋白呈低度浸润有54例,低度浸润率达83.1%。统计学分析表明,肝癌组织中B7-H4的表达水平与肿瘤内CD4+,CD8+T淋巴细胞浸润程度,功能性细胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌均呈负相关(P=0.034,P=0.005,P=0.014,P=0.002),其中,B7-H4表达水平与CD8+T淋巴细胞浸润程度及IFN-γ分泌呈显著负相关(P=0.005,P=0.002)。(3)Western Blot技术检测肝癌及癌旁组织中B7-H4、TGF-β1和IFN-γ蛋白表达水平结果表明,与癌旁组织相比,12例(80.0%)肝癌组织中B7-H4表达明显上调,而细胞因子TGF-β1和IFN-γ表达明显下降,统计学分析显示,人肝癌组织中B7-H4表达明显高于癌旁组织,功能性细胞因子TGF-β1和IFN-γ表达明显低于癌旁组织,B7-H4的表达水平与TGF-β1及IFN-γ分泌呈负相关。(4)Western Blot技术检测肝癌及癌旁组织中纯化分离出CD8+T细胞中B7-H4,IFN-γ蛋白及自噬通路PI3K-AKT-m TOR-LC3I-LC3II中相关蛋白的表达情况。结果表明,与癌旁组织相比,肝癌组织中B7-H4表达明显上调,而细胞因子IFN-γ表达明显下降。与癌旁组织相比,肝癌组织CD8+T细胞中自噬通路PI3K/AKT/m TOR中P-AKT,P-m TOR表达上调,同时LC3-I蛋白表达下降,自噬标志蛋白LC3-II蛋白表达显著增加。提示了在肝癌组织中B7-H4表达上调促进CD8+T细胞发生异常自噬。结论:1、人原发性肝癌组织中B7-H4表达显著高于癌旁组织和正常肝组织,肝癌组织中B7-H4表达水平与淋巴结转移、肿瘤浸润深度及TNM分期呈正相关关系,而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤细胞分化程度无相关性。结果表明B7-H4作为人原发性肝癌的肿瘤标志物具有敏感性及特异性。2、人原发性肝癌组织中B7-H4表达水平与肿瘤内CD4+,CD8+T淋巴细胞浸润程度,功能性细胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌均呈负相关。结果提示肝癌组织中B7-H4表达上调抑制T淋巴细胞增殖及功能性细胞因子分泌,从而诱导免疫抑制。3、人原发性肝癌组织中B7-H4表达上调,而抗肿瘤效应的IFN-γ表达下降,同时CD8+T细胞自噬信号通路PI3K/AKT/m TOR活化明显,LC3II蛋白表达明显上调,CD8+T细胞发生异常自噬。进一步提示肝癌组织中B7-H4表达上调可能通过PI3K/AKT/m TOR信号通路促进CD8+T细胞发生异常自噬,从而抑制CD8+T的增殖及功能性细胞因子IFN-γ的分泌,介导免疫抑制。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【参考文献】