线粒体钙单向转运体在1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞凋亡中的作用

发布时间：2018-01-31 20:47

  本文关键词： MCU PGC-1α 细胞凋亡 ROS 帕金森　出处：《南方医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中老年人神经系统变性疾病,它以黑质致密部(SNpc)多巴胺能(DA)神经元的选择性丢失为特点,临床症状包括肌肉强直、静止性震颤、运动迟缓和姿态不稳等。帕金森病具有严重持续进展性、致残性以及目前治疗上的“无法治愈性”,严重威胁着人类的生命健康和生存质量。迄今为止,人们尚未完全了解帕金森的发病机制,也还没有确切可靠的药物根治帕金森病。越来越多的体外、体内及人体实验研究指出细胞凋亡与帕金森病密切相关。因此,阐明帕金森病与细胞凋亡间的联系,阻止神经元细胞凋亡,从而减慢或阻止帕金森病进程显得尤为重要。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株,具有多巴胺神经元的特征,已被广泛用做PD研究的神经元模型细胞。MPP+作用于PC12细胞可诱导PD模型的形成,已被广泛地运用于PD的实验研究。50年代科学家使用电子显微镜观察了一位PD患者中脑的黑质部位,发现在黑质部位出现了一些类似凋亡的高密度的细胞核聚集特征。Mochizuki通过末端酶标记法(TUNEL)检测发现,黑质部位的多巴胺能神经细胞有0.6%-4.8%发生凋亡。显示帕金森与中脑多巴胺能神经元凋亡有密切关系。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)可引起帕金森病的症状,故被广泛用来建立帕金森病细胞模型和动物模型,对帕金森的发病机制进行研究。目前研究表明,MPP+作为一种外源性毒物引起帕金森的机制是通过氧化应激机制和抑制线粒体电子呼吸链的复合体的活性,最终导致多巴胺神经元凋亡。作为第二信使的Ca2+在信号转导中具有重要作用,研究显示,无论是在早期还是晚期细胞内钙离子浓度升高都有促进细胞凋亡的作用。正常情况下,细胞质中的Ca2+浓度很低,而细胞外、线粒体和内质网中的Ca2+浓度要比细胞质中高,因而胞内Ca2+库的Ca2+释放和胞外Ca2+内流均能使细胞质内的Ca2+浓度大幅度增高,从而激活Ca2+依赖性激酶,引起一系列生化反应。线粒体是细胞钙的缓冲器,具有摄取、释放Ca2+以及调节胞浆Ca2+浓度的能力。线粒体通过位于线粒体内膜上低亲和力、高选择性的离子通道线粒体钙单向转运体MCU摄取Ca2+MCU定位于线粒体内膜,由MICUl(调节伴侣)和MCU(成孔亚基)组成。尽管MCU与Ca2+亲和力低,但当细胞受到刺激时,线粒体的基质Ca2+浓度能([Ca2+]mt)迅速改变,这是由于线粒体与ER或质膜上的Ca2+通道相邻,线粒体低亲和力的摄钙系统暴露于高Ca2+浓度的微域,从而有利于线粒体的钙摄入。过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPAR γ)辅激活因子la (PGC-1α)是一种功能强大的转录调节因子,可强有力调控氧化和抗氧化过程,在线粒体生物学过程和氧化应激中具有突出的作用,其广泛参与各种新陈代谢通路的调节,如能量代谢、线粒体生物合成、糖脂代谢等。在MPTP小鼠模型上,过表达PGC-la能保护多巴胺神经元免于MPTP导致的毒性作用。PGC-1α敲除小鼠,对低剂量MPTP处理比野生型小鼠更加敏感,有神经变性的损害。PGC-1α、MCU是否在MPP+诱导的PC12细胞凋亡中发挥作用,以及具体的作用、机制如何,尚未见文献报道。因此,本研究主要探讨PGC-1α、MCU是否参与MPP+诱导的PC12细胞凋亡,以及它在其中扮演何种角色,为今后开发帕金森病的治疗药物提供理论依据。目的探索MPP+诱导的PC12细胞的凋亡的机制;明确PGC-1α、MCU是否参与MPP+诱导的PC12细胞的凋亡；探讨MCU通过何种机制参与MPP+诱导的PC12细胞的凋亡；改变PGC-1α表达对MPP+诱导细胞凋亡率的影响；ROS在MPP+致凋亡中的作用。方法1、在37℃培养箱(5%CO2、95%空气)内培养大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞(PC12)细胞,取对数生长期细胞。分别用不同浓度的MPP+(0mM、0.5mM、 1mM、2mM、4mM)处理PC12细胞不同时间(24h、28h)后,MTT法检测细胞活力,观察不同浓度MPP+干预PC12细胞后的细胞活力变化。2、1mM　MPP+处理PC12细胞24h后,使用Hoechst法、流式细胞仪技术检测PC12细胞凋亡。3、用不同浓度(OmM、0.5mM、1mM、2mM、4mM)的MPP+处理PC12细胞24h, Western-Blot免疫印迹法检测PC12细胞内PGC-1α、MCU 蛋白表达变化。4、用MCU激动剂精胺和MCU抑制剂Fu360、MCU过表达质粒和干扰片段转染处理后,再加1mMMPP+处理PC12细胞后检测细胞凋亡率的变化。5、MCU过表达质粒和干扰片段转染、PGC-1 α干扰转染处理后,再加1mMMPP+处理PC12细胞后检测细胞氧化应激变化。6、PGC-la干扰转染处理后,Western-Blot免疫印迹法检测PGC-1α干扰后MCU蛋白表达变化。结果1 MPP+导致PC12细胞增殖活力下降,并具有剂量和时间反应关系MPP+浓度在0～4mM内,作用24h和48h时,PC12细胞存活率均随着浓度的增加逐渐降低,各个加药组细胞存活率与对照组相比,差异均有统计学意义(p0.05)。2 MPP+可诱导PC12细胞凋亡在光学显微镜下我们可看到正常PC12细胞体积较大,多呈梭型,表面有少量较细长的突起,核大呈梭型；用1mM的MPP+作用于PC12细胞24h后,PC12细胞核体积变小,细胞变圆。用终浓度5μg/ml Hoechst 33342染细胞核,荧光显微镜下可看到PC12细胞的细胞核出现细胞固缩、破碎等凋亡的特征性表现。1mM MPP-处理PC12细胞24h后,PARP出现切割；流式细胞仪测细胞凋亡率,结果显示,PC12细胞凋亡率上升,差异具有统计学意义。3不同浓度MPP+对PC12细胞PGC-lα、MCU表达量的影响用不同浓度的MPP+处理PC12细胞24h,观察MCU表达量的变化。结果显示,随着MPP+作用浓度升高,PGC-1α蛋白的表达量逐渐上升,MCU蛋白的表达量逐渐下降,表明MPP+作用于PC12细胞影响PGC-1α、MCU蛋白的表达量。4阻断及激活MCU对MPP+诱导PC12细胞凋亡率的影响通过前面实验,我们知道MPP+影响PC12细胞MCU的表达量,那么MCU是否参与了MPP+诱导的PC12细胞凋亡呢?我们采用MCU的阻断剂Ru360(10μM)和激活剂Sper(20μM)分别预处理PC12细胞1h后再加入MPP+作用24h,检测Ru360和Sper预处理对MPP+诱导PC12细胞凋亡率的影响。我们发现,Ru360+　MPP+组与仅MPP+处理组相比,细胞胞凋亡率上升,差异具有统计学意义(p0.05); Sper+MPP+组与仅MPP+处理组相比,细胞凋亡率下降,差异具有统计学意义(p0.05)。结果表明,MCU的阻断剂Ru360预处理导致MPP+诱导PC12细胞凋亡率上升,而MCU的激活剂Sper预处理导致MPP+诱导PC12细胞凋亡率下降。5干扰及过表达MCU对MPP+诱导PC12细胞凋亡率的影响为进一步验证MCU在MPP+诱导PC12细胞凋亡中的作用,我们分别采用RNA干扰和过表达技术,下调和上调MCU的表达,免疫印迹法验证干扰效率。MCU下调或上调后,加入1mM MPP+处理24h,观察MCU下调或上调对MPP+诱导PC12细胞凋亡的影响。结果显示,下调MCU导致MPP+诱导PC12细胞凋亡率上升,而上调MCU导致MPP+诱导PC12细胞凋亡率下降,差异具有统计学意义(p0.05)。上述结果表明,MCU参与了MPP+诱导PC12细胞的凋亡过程。6 MCU干扰及过表达在MPP+处理PC12细胞后的ROS含量变化MCU干扰及过表达后用1mMMPP+处理PC12细胞24h用ROS检测试剂盒检测这一过程ROS含量变化。结果显示,MCU干扰组ROS显著升高,MCU干扰可加重MPP+诱导的PC12细胞氧化应激状态。MCU过表达组ROS显著性下降,MCU过表达后可减轻MPP+诱导的PC12细胞氧化应激状态。7改变PGCla表达对MPP+诱导细胞凋亡率的影响PGC-1a干扰片段1,干扰片段2和干扰片段3处理PC12细胞后可使MCU蛋白表达显著性上升,PGC-1α可能是调控MCU的一个重要的转录调节因子。与scrambled组相比,PGC-1α干扰片段处理组ROS水平显著上升,说明PGC-1 α干扰可加重MPP+诱导的PC12细胞氧化应激状态,进一步说明PGC-1α参与MPP+诱导的神经元细胞氧化应激这一过程。8 ROS在MPTP致凋亡中的作用用1mM MPP+处理PC12细胞24h,利用荧光探针DCFH-DA检测PC12细胞活性氧的含量,结果与control组相比,1mM　MPP+处理PC12细胞使ROS显著增多。用20mM　NAC预处理PC12细胞1h,然后用1mM　MPP+处理PC12细胞24h,结果说明NAC预处理ROS下降。用20mM　NAC预处理PC12细胞1h,然后用1mM　MPP+处理PC12细胞24h。结果说明,随着MPP+浓度的升高,PGC-1α蛋白显著性减少,MCU蛋白显著性升高。这表明NAC预处理可能对PGC-1α蛋白和MCU蛋白有一定的调控作用,氧化应激在MPP+处理PC12细胞中起作用。结论本研究的结果显示,MPP+可诱导PC12细胞的凋亡。MPP+处理可使PC12细胞的PGC-1α蛋白表达上调,MCU蛋白表达下降。阻断、干扰或激活、过表达MCU对MPP+诱导的PC12细胞凋亡分别起到协同和拮抗作用,PGC-1α干扰后可使MCU蛋白表达量上调。这些结果说明PGC-1α作为线粒体上重要的转录调节因子,可调控氧化和抗氧化过程和作为线粒体内膜上重要的钙内流通道蛋白MCU,参与且能抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。
[Abstract]:Parkinson ' s disease ( PD ) is a common neurodegenerative disease in the middle - aged and old people . It is characterized by the selective loss of dopaminergic neurons in the nigra dense part ( SNpc ) . The clinical symptoms include muscular rigidity , static tremor , slow motion and unstable posture . To date , the mechanism of Parkinson ' s disease has been studied by electron microscopy . The apoptosis of PC12 cells induced by MPP + was investigated by Western - Blot and Western - Blot . The apoptosis rate of PC12 cells induced by MPP + was significantly higher than that in MPP + treated group . 杩涗竴姝ヨ�存槑PGC-1伪鍙備笌MPP+璇卞�肩殑绁炵粡鍏冪粏鑳炴哀鍖栧簲婵�杩欎竴杩囩▼.8 ROS鍦∕PTP鑷村噵浜′腑鐨勪綔鐢ㄧ敤1mM MPP+澶勭悊PC12缁嗚優24h,鍒╃敤鑽у厜鎺㈤拡DCFH-DA妫，

本文编号：1479964