贝伐珠单抗与顺铂、5-FU不同时序给药方式对胃癌的影响及其机制的研究

发布时间：2018-01-31 23:40

本文关键词： 胃癌贝伐珠单抗化学疗法给药时序 AKT 凋亡　出处：《河北医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在我国,胃癌的发病率很高,由于胃癌筛查没有得到普及和重视,大多数胃癌到中晚期才得到诊断,且由于胃部肿瘤原发或继发性耐药的产生致使肿瘤对化疗不敏感,往往导致治疗无效或失败。近年来,对肿瘤耐药相关基因功能的研究揭示了众多的肿瘤耐药机制,在指导临床治疗中逐渐凸显出重要的作用,然而由于揭示这些基因功能的相关研究相对独立,还难以据此整合形成一套行之有效的治疗手段。因此,目前临床治疗胃癌的方法中,化疗仍是主要的治疗手段。近年来研究显示,在胃癌化疗临床药物的选择中,顺铂(cisplatin,CDDP)联合氟尿嘧啶以及其衍生物仍是基础化疗药物之一。“抗肿瘤血管生成”是19世纪70年代由Folkman教授提出的治疗肿瘤的全新理念,是肿瘤治疗领域的里程碑式的标志。在此之后,贝伐珠单抗、恩度、索拉菲尼、舒尼替尼等抗血管生成类药物相继被研发。目前,国内针对恩度抗血管生成药物时间窗研究较多。而对舒尼替尼、索拉菲尼、贝伐珠单抗等抗血管生成药物时间窗研究较少,其抗血管生成的作用机理、毒副反应、单用还是与化疗药物联用,如何联用更有优势等方面进行研究还有待开展。早在2004年,贝伐珠单抗就已经被美国FDA批准上市,被用于治疗转移性结直肠癌、非小细胞肺癌、复发性胶质母细胞瘤以及某些肾癌。2012年,贝伐珠单抗联合标准化疗首次被欧盟委员会批准用于治疗复发性卵巢癌。目前,有研究表明:作为人源化单克隆抗体,贝伐珠单抗中的鼠源性组成部分特异性地结合VEGF,从而阻断其与Qg源性VEGFR的结合,进而限制其生物学活性、抑制新生血管形成以及降低血管通透性。MGC 803是胃癌VEGF表达的细胞株。本研究对不同时序条件下贝伐珠单抗联合化疗对人胃癌细胞株(MGC 803)的抑制作用进行了分析;建立了MGC 803细胞荷瘤裸鼠模型,进一步探讨了不同时序条件下贝伐珠单抗联合化疗给药方式对胃癌荷瘤小鼠的治疗效果:通过小动物活体成像技术对抗血管生成药物疗效进行实时监测;同时通过流式细胞技术、westernblot以及免疫组化技术检测,观察vegf/akt通路及凋亡蛋白bcl-2和bax的变化和mvd,bax,bcl-2与vegfr表达;分析并探讨不同时序条件下贝伐珠单抗联合化疗的给药方式对胃癌荷瘤裸鼠治疗的分子机制,以及贝伐珠单抗抗血管生成的时间窗问题。第一部分不同时序条件下贝伐珠单抗联合顺铂、5-fu对人胃癌细胞株(mgc803)抑制作用及其相关机制的探究目的:研究不同时序条件下贝伐珠单抗联合顺铂、5-fu对人胃癌细胞株(mgc803)抑制作用及其机制,尝试找到抗血管生成药物贝伐珠单抗与细胞毒药物的最佳联合时序。方法:体外培养人胃癌细胞mgc803,不同时序条件下,贝伐珠单抗联合化疗处理细胞,mtt法检测mgc803细胞的生长抑制情况,流式细胞仪(pi染色)分析细胞周期分布相和细胞凋亡率。结果:1mtt测定不同单药、不同浓度的胃癌细胞株mgc803的抑制率差异均有统计学意义(p0.05),进一步做两两比较,各单药不同浓度间的抑制率差异均有统计学意义(p0.05),随着浓度的增高,抑制率逐渐增高。2mtt测定不同时序联合给药对胃癌细胞株mgc803的抑制率差异有统计学意义(p0.001),进一步做两两比较,抑制率最高的为fp(顺铂、5-fu)化疗前24小时联合贝伐珠单抗(68.63%),其次为fp化疗前48小时联合贝伐珠单抗(63.46%)和fp化疗前72小时联合贝伐珠单抗(62.89%),再次为fp化疗同时联合贝伐珠单抗(60.96%)和fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗(59.64%),再次为fp化疗后48小时联合贝伐珠单抗(57.53%)和fp化疗后72小时联合贝伐珠单抗(56.63%),单纯fp方案化疗组最低(52.33%)。表明先给予贝伐株单抗,再给予fp化疗的联合方案对胃癌细胞生长具有高效的抑制作用。3不同时序给药对胃癌细胞株mgc803细胞周期g0/g1期和g2/m期差异均无统计学意义(p0.05),s期差异有统计学意义(p0.001),进一步做两两比较,s期最高的为fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗(48.13),均高于其他各组(p0.05);最低的为单纯fp方案化疗组(23.50),均低于其他各组(p0.05),其余各组间差异均无统计学意义(p0.05)。表明fp化疗前24小时给予贝伐株单抗的联合方案明显诱导胃癌细胞出现s期细胞阻止。4不同时序给药的胃癌细胞株mgc803凋亡率差异有统计学意义(p0.001),进一步做两两比较,凋亡率最高的为fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗(4.76),其次为fp化疗前48小时联合贝伐珠单抗(3.41)、fp化疗前72小时联合贝伐珠单抗(3.32)、fp化疗同时联合贝伐珠单抗(2.99)和fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗(2.90),再次为fp化疗后48小时联合贝伐珠单抗(2.21)、fp化疗后72小时联合贝伐珠单抗(2.57)和单纯fp方案化疗组(2.14)。结果表明fp化疗前24小时给予贝伐株单抗的联合方案明显促进胃癌细胞凋亡。结论:1不同时序对胃癌细胞株mgc803的抑制率不同,抑制率最高的为fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗。2不同时序给药可以诱导胃癌细胞株mgc803细胞周期s期阻滞,其中fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗诱导s期阻滞最显著。3不同时序给药的胃癌细胞株mgc803凋亡率不同,诱导细胞凋亡最显著的为fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗。第二部分利用小动物活体成像技术探讨贝伐珠单抗与顺铂、5-fu不同时序给药方式对胃癌荷瘤小鼠治疗疗效的影响目的:通过小动物活体成像系统观察带有荧光标记的肿瘤细胞在裸鼠体内的生长变化,进一步在整体动物水平上比较贝伐珠单抗联合顺铂、5-fu不同时序给药方式的抗肿瘤疗效的差异。方法:采用贝伐珠单抗联合fp方案化疗不同时序给药方式对人胃癌裸鼠皮下种植模型的肿瘤生长进行干预治疗,通过肿瘤体积计算抑制率,荧光信号值的变化观察肿瘤生长情况。实验分组和给药时序如下:第一组a组为贝伐珠单抗+fp化疗同时治疗组;第二组b组为fp化疗24小时后给予贝伐珠单抗;第三组c组为贝伐珠单抗24小时后给予fp化疗;第四组d组为单药贝伐珠单抗;第五组e组对照组,腹腔注射生理盐水。结果:1不同组别裸鼠体重变化差异无统计学意义(p=0.219),治疗后不同时间点体重变化差异有统计学意义(p0.001),时间与组别间存在交互作用(p=0.031)。进一步做两两比较,a组不同时间点裸鼠体重变化差异无统计学意义(p=0.773),b,c,d,e组裸鼠体重随时间均有增加趋势(p0.05)。2根据肿瘤体积计算各组抑瘤率分别为a组抑瘤率为40.95%,b组抑瘤率为37.57%,c组抑瘤率为68.42%,d组抑瘤率为19.84%。不同组别裸鼠肿瘤体积变化差异无统计学意义(p=0.166),治疗后不同时间点肿瘤体积变化差异有统计学意义(p=0.006),时间与组别间存在交互作用(p0.001),进一步做两两比较,用药前和用药一周后不同组别差异均无统计学意义(p0.05),用药第2周和第3周不同组别差异均有统计学意义(p0.05),体积由小到大依次为c,a,b,d,e,c组体积明显低于d组和e组(p0.05),a,b,d组不同时间点裸鼠肿瘤体积变化差异均无统计学意义(p0.05),c组裸鼠肿瘤体积随时间呈降低趋势(p0.05),e组裸鼠肿瘤体积随时间呈增加趋势(p0.05)。3不同组别裸鼠肿瘤荧光信号变化差异有统计学意义(p0.001),治疗后不同时间点肿瘤荧光信号变化差异有统计学意义(p0.001),时间与组别间存在交互作用(p0.001),进一步做两两比较,用药前不同组别差异无统计学意义(p=0.074),用药第1周、第2周和第3周不同组别差异均有统计学意义(p0.05),第1周和第2周,e组均高于a,b,c,d组,第3周,荧光信号由低到高依次为c,a,b,d,e组,a组、c组裸鼠肿瘤荧光信号第3周低于用药前(p0.05),e组裸鼠肿瘤荧光信号随时间呈增加趋势(p0.05)。结论:1贝伐珠单抗与fp联合,具有协同作用,且先于fp化疗应用时肿瘤抑制率最为显著。2通过在体实验研究,利用小动物活体成像系统动态获得肿瘤长径和短径以及荧光信号值,客观敏感的发现肿瘤体积不再缩小的时间点,荧光信号继续衰减,即药物继续发挥着抗肿瘤作用。第三部分贝伐珠单抗与顺铂、5-fu化疗不同时序给药方式对胃癌细胞治疗疗效的分子机制目的:检测不同时序贝伐珠单抗联合fp化疗处理后的人胃癌细胞株(mgc803)以及荷瘤裸鼠肿瘤组织akt,bax,bcl-2,cyclind1,p21,pi3k,mvd的表达情况,初步探究fp化疗前给予贝伐珠单抗的联合用药时序诱导胃癌细胞毒性作用的生物学机制,旨在进一步为临床上使用贝伐珠单抗联合fp方案治疗胃癌提供相应的理论依据。方法:通过westernblot、免疫组化技术检测不同时序贝伐珠单抗联合化疗处理后,对人胃癌细胞株(mgc803)以及荷瘤裸鼠肿瘤组织中akt,bax,bcl-2,cyclind1,p21,pi3k,mvd,vegfr表达的影响。结果:1不同时序联合给药对胃癌细胞株mgc803相关蛋白表达的影响不同时序联合给药处理胃癌细胞株mgc803后:各组pi3k,akt,p21蛋白表达与单独化疗组相比较,均具有显著统计学差异(p0.05)。进一步做两两比较,表达量最高的为fp化疗组,分别为:pi3k(1.11±0.03),akt(1.27±0.09),p21(1.51±0.04);其次为fp化疗后72小时联合贝伐珠单抗,分别为:pi3k(0.97±0.04),akt(1.13±0.10),p21(1.38±0.05),cyclind1以及fp化疗后48小时联合贝伐珠单抗,分别为:pi3k(0.90±0.05),akt(1.04±0.12),p21(1.35±0.05);fp化疗前24小时方案联合组最低,分别为:pi3k(0.07±0.03),akt(0.02±0.01),p21(0.13±0.02),其显著性的治疗疗效可能通过抑制pi3k和akt发挥作用。除fp化疗前48小时联合贝伐珠单抗处理组外,其余各组bcl-2蛋白表达与单独化疗组相比较明显降低,(p0.05)。进一步做两两比较,表达量最高的为单纯化疗组(1.12±0.04),其次为fp化疗后72小时联合贝伐珠单抗(1.00±0.06)以及fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗(0.74±0.04);fp化疗前24联合贝伐珠单抗方案组最低(0.05±0.04)。各组bax蛋白表达与单独化疗组相比较,均具有显著统计学差异(p0.05),进一步做两两比较,表达量最高的为fp化疗前72小时联合贝伐珠单抗(1.02±0.04),其次为fp化疗前48小时联合贝伐珠单抗(0.99±0.05)以及fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗组(0.95±0.04);fp化疗组最低(0.07±0.01)。各组cyclind1蛋白表达与单独化疗组相比较,均具有显著统计学差异(p0.05),进一步做两两比较,表达量最低的为单纯化疗组(0.04±0.03),其次为fp化疗后72小时联合贝伐珠单抗(0.13±0.05)以及fp化疗前48小时联合贝伐珠单抗(0.28±0.05);fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗方案组最高(0.71±0.05)。2不同时序联合给药对荷瘤裸鼠肿瘤组织相关蛋白表达的影响对荷瘤(胃癌细胞株mgc803)裸鼠进行不同时序贝伐珠单抗以及化疗的联合给药处理后:各组pi3k,akt,bcl-2蛋白表达的相对光密度值(od)与空白对照组相比较,均具有显著统计学差异(p0.05),进一步做两两比较,表达量最高的为空白对照组,分别为pi3k(0.73±0.04),akt(1.13±0.05),bcl-2(1.40±0.04),其次为fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗pi3k(0.44±0.03),akt(0.46±0.02),bcl-2(1.14±0.04)和贝伐珠单抗单药pi3k(0.14±0.03),akt(0.35±0.03),bcl-2(0.74±0.04),再次为fp化疗联合贝伐珠单抗同时给药pi3k(0.09±0.03),akt(0.25±0.03),bcl-2(0.52±0.02);fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗最低pi3k(1.13±0.05),akt(0.06±0.03),bcl-2(0.19±0.02)。各组p21蛋白表达的相对光密度值(od)与空白对照组相比较,均具有显著统计学差异(p0.05),进一步做两两比较,表达量最高的为fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗(0.85±0.02);其次为贝伐珠单抗单药(0.61±0.02)和fp化疗联合贝伐珠单抗同时给药(0.48±0.04);fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗(0.43±0.01)和空白对照组(0.43±0.03)最低。各组bax蛋白表达的相对光密度值(od)与空白对照组相比较,均具有显著统计学差异(p0.05),进一步做两两比较,表达量最高的为fp化疗前24小时联合贝伐珠单抗组(1.27±0.03);其次为贝伐珠单抗单药(0.85±0.04)和空白对照组(0.83±0.03);fp化疗联合贝伐珠单抗同时给药(0.82±0.03)和fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗(0.77±0.02)最低。其中,fp化疗后24小时联合贝伐珠单抗组与fp化疗同时联合贝伐珠单抗组比,统计学差异不显著;贝伐珠单抗单药组与空白对照组组比,差异不显著;上述前两组与后两组相比,具有显著统计学差异(p0.05)。各组Cyclin D1蛋白表达的相对光密度值(OD)与空白对照组相比较,均具有显著统计学差异(P0.05),进一步做两两比较,表达量最低的为空白对照组(0.31±0.04);其次FP化疗同时联合贝伐珠单抗组(0.36±0.02)和FP化疗后24小时联合贝伐珠单抗(0.46±0.02);再次为为贝伐珠单抗单药(0.64±0.02);FP化疗前24小时联合贝伐珠单抗组最高(0.92±0.01)。结论:1从细胞水平看,FP方案化疗前联合贝伐珠单抗组,通过对MGC-803细胞PI3K/AKT信号通路的调控:上调Bax,Cyclin D1,下调Bcl-2,P21蛋白的表达最明显,进而阻止肿瘤细胞增殖作用最强;2在荷瘤小鼠上,FP化疗前联合贝伐珠单抗组具有明显作用,上调Bax,Cyclin D1,下调Bcl-2,P21蛋白,其中FP化疗前24小时联和贝伐珠单抗组下调细胞PI3K/AKT信号通路最显著,其抑瘤效果最理想。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】