MiR-144-451基因簇与食管癌发病关系研究

发布时间：2018-02-01 17:17

本文关键词： 食管癌 miR-144-451 基因簇肿瘤生物标志物　出处：《东南大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：miRNA可以与mRNA的3'UTR区结合,调控相应编码蛋白表达,在基因转录后调控中发挥重要作用。miRNA调控异常可致机体细胞功能异常,研究发现miRNA异常表达与肿瘤发生密切相关, miRNA可能成为肿瘤诊断的重要分子标志物。部分miRNA的编码基因在染色体上位置紧邻,成簇排列形成miRNA基因簇,研究发现这些成簇排列的miRNA在表达和功能上具有较高的相关性,miRNA基因簇可能作为一个功能单位,整体调控生物信号传导通路。作为潜在的生物标志物,miRNA基因簇能够更好的反映miRNA对机体复杂的网络调控,因而更加灵敏、可靠。本研究在江苏省淮安食管癌患者食管癌组织和癌旁组织中分析了miR-144-451基因簇的表达特征,探讨了miR-144-451基因簇异常表达与食管癌发病风险的关系；并进一步在miR-144-451基因簇的稳转细胞模型中初步探讨了miR-144-451基因簇在食管癌发生发展中的生物学功能及调控机制。一、miR-144-451基因簇与食管癌发病风险的病例对照研究招募淮安市第一人民医院2011～2012年101例病理确诊食管癌患者。使用QRT-PCR技术分别检测食管癌组织和配对癌旁组织中miR-144-451基因簇单一miRNA(miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732、miR-4732-5p)的表达,与癌旁组织相比,食管癌组织中miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a显著低表达,其表达量2-△△CT分别是癌旁组织的37.6%、46.7%、44.3%,miR-4732-5p、miR-4732-3p的表达在癌组织和癌旁组织中没有统计学差异。应用单纯病例研究分析环境因素与miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a表达改变之间的关系,结果显示miR-144-3p、miR-144-5p的异常表达与喜食硬食有交互作用,miR-144-5p、miR-451a异常表达与饮水类型有交互作用(P0.05)。基于miR-144-451基因簇内的miRNAs可能存在共表达的特征,对各miRNA表达量经数据转换后进行Pearson相关性分析,结果显示5种miRNA两两之间表达相关性均具有统计学意义(P0.001),其中miR-4732-5p与miR-144-5p表达高度相关(P0.731)。进一步应用主成分Logistic回归分析,识别了miR-144-451基因簇中的两个代表性miRNAs: miR-144-3p和miR-144-5p,两者的低表达可增加食管癌的发病风险。二、miR-144-451基因簇对食管癌细胞生物行为影响1使用miRNA mimics转染EC9706细胞,分别获得miR-144-3p、miR-144-5p、 miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p过表达细胞模型,研究分析基因簇中各miRNA对细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、和凋亡能力的影响。(1)使用流式细胞术(Annexin V-FITC标记)检测miRNA mimic转染48h后细胞的凋亡率,miR-144-3p过表达细胞早期凋亡率为(18.70±2.11)%,较对照组(9.00±1.15)%明显升高(P0.05)。miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p过表达细胞凋亡率分别为(8.43+3.26)%、(10.00±0.90)%、(9.73±0.64)%、(9.40±0.61)%,与对照组相比凋亡率差异均没有统计学意义。(2)使用流式细胞技术(PI染色)检测miRNA mimic转染48h后细胞的周期分布。miR-451a过表达细胞中G2期所占比例为(22.84+0.97)%,与对照组(18.20±1.12)%相比增加了25%。miR-144-3p过表达细胞中(32期所占比例(14.62±1.41)%与对照组(18.20±1.12)%相比下降了20%。(3)使用Transwell小室检测细胞的迁移能力,miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p可以抑制EC9706细胞的迁移能力,其对应转染组穿膜细胞数分别为15.63±1.00、21.27±1.70、26.97±3.47,较对照组(36.67±3.58)穿膜细胞数均有明显降低。miR-144-3p、 miR-451a、miR-4732-3p穿膜细胞中结晶紫OD值低于对照组,差异有统计学意义。(4)使用Transwell小室检测细胞侵袭能力,miR-144-3p过表达细胞穿膜数为12.07±1.10,明显低于对照组穿膜细胞数(25.90±2.26)。miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p、miR-4732-5p过表达对细胞的侵袭能力无影响。(5)使用EdU染色成像法检测细胞增殖能力,miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p过表达细胞增殖率分别分别为(34.18±.83)%、(33.56±3.94)%、(34.15±2.94)%、(31.50±2.01)%,与对照组(41.16±2.13)%相比,四组细胞增殖率均降低。2构建pri-miR-144-451过表达载体,使用慢病毒包装并转染,经抗生素筛选获得稳定表达pri-miR-144-451细胞。分别检测稳定表达pri-miR-144-451 EC9706细胞的凋亡、周期、迁移、侵袭、增殖能力,以评价miR-144-451基因簇整体对食管癌细胞影响。结果显示miR-144-451基因簇可以导致EC9706细胞周期阻滞于S和G2期,发挥抑癌基因作用；miR-144-51基因簇可以明显抑制EC9706细胞的侵袭能力,与对照细胞相比pri-miR-144-451过表达并没有引起细胞凋亡、侵袭、增殖能力的改变。三、miR-144-451基因簇在EC9706中调控通路分析1使用Targetscan、miRanda、miRDB、PICTAR预测miR-144-3p、miR-144-5p、 miR-451a的靶基因,对预测的靶基因使用DAVID Bioinformatics Resources 6.7进行生物学功能富集分析,结果显示miR-144-3p的靶基因最多富集在转录调控功能,其次为细胞形态功能omiR-144-5p的靶基因最多富集在转录调控功能,其次为转录功能。miR-451a的靶基因最多富集于增殖调控功能。2使用Western Blot分别检测miRNA mimic(miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p、miR-4732-5p、miR-control)转染细胞、pri-miR-144-451稳转细胞(pri-miRNA、pri-control)中相应蛋白的表达。蛋白的相对表达量A=目的蛋白IOD/内参IOD。(1) miRNA mimic转染组和pri-miRNA组β-Catenin总蛋白、非磷酸化β-Catenin蛋白表达无改变,miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p处理组细胞中磷酸化β-Cateriin的表达与miR-control对照组相比略有增加。与对照组相比,pri-miRNA组磷酸化β-Catenin表达增加。(2)与对照相比miR-144-3p处理组c-Myc总蛋白表达降低,miR-144-5p处理组c-Myc总蛋白表达升高；与pri-control组相比pri-miRNA组细胞中c-Myc总蛋白表达升高。miR-144-3p组细胞磷酸化c-Myc蛋白表达降低,pri-miRNA组磷酸化c-Myc表达升高。(3)不同处理组间PTEN和ERK1/2表达无差异。miR-144-3p、miR-451a、 miR-4732-3p组磷酸化ERKl/2表达较miR-control组降低；pri-miRNA组磷酸化ERK1/2表达低于pri-control组。(4) miR-4732-5p处理组p53表达明显升高; pri-miRNA组p53蛋白表达较pri-control组升高。miR-144-3p过表达组非活化Caspase3表达较miR-control组表达降低。(5)与miR-control组相比, miR-144-3p、miR-4732-5p转染组细胞MMP9表达降低；pri-miR-144-451稳转细胞中MMP9呈低表达。(6) miR-144-3p、miR-144-5p过表达细胞磷酸化cdc2表达较miR-control组表达降低。pri-miRNA组磷酸化Cdc2表达则明显增加。四、主要结论：(1)miR-144-451基因簇成员miRNA在食管癌和癌旁组织中表达高度相关,miR-144-451基因簇中miR-144-3p、miR-144-5p低表达可增加食管癌的发病风险,是食管癌的危险因素。(2)miR-144-451基因簇可以抑制食管癌细胞的侵袭能力,使食管癌细胞G2、S期细胞增加,G1期细胞减少。其中miR-144-3p可以促进食管癌细胞早期凋亡；miR-451a可以使细胞周期阻滞于G2期；miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p抑制细胞迁移；miR-144-3p可以抑制食管癌细胞侵袭能力；miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p可以抑制细胞增殖能力。(3)miR-144-451基因簇可以抑制Wnt通路、MAPK/ERK/c-Myc信号通路。miR-144-451基因簇过表达导致MMP9被抑制,周期相关蛋白的p-cdc2表达升高,食管癌细胞周期、侵袭抑制可能与此有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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