microRNA-141在结直肠癌中的表达及调控机制研究

发布时间：2018-02-02 16:25

本文关键词： miRNA-141 结直肠癌生物学功能生物信息学靶基因　出处：《河北医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在我国,结直肠癌是非常常见的恶性消化系统肿瘤,近20年来尤其在大城市,发病率明显上升,据《2015年中国肿瘤登记年报》发布数据,结直肠癌的发病率已超过肝癌,仅次于肺癌和胃癌,在恶性肿瘤中排列第三;在恶性肿瘤的死亡率排列第五,次于肺癌、肝癌、胃癌和食管癌。在国内,结直肠癌的早期诊断率仍然很低,约60%的患者为中晚期。除此之外,结直肠癌呈现出患病人数多及较低的5年生存率等特征。上述,也是结直肠癌成为癌症患者主要死因的根源。手术,可以说是结直肠癌有望治愈的唯一方式。然而,很多患者即便接受过结直肠癌根治术,还是可能再次复发甚至是转移。术后,采取辅助放化疗方案来对结直肠癌患者进行治疗,或可减少复发和转移风险。对晚期结直肠癌患者来说,化疗在综合性治疗中同样起着极为关键的作用。但是,结直肠癌患者在化疗期间,始终会有无法回避的问题——耐药。由此可见:越早对结直肠癌患者进行规范化诊治,其5年生存率越能得以提高。因此,探索敏感性较强的分子标志物,找到分子靶标和做好预后评估,这是十分重要的。mi RNA属于重要的非编码小分子RNA,在机体中呈现内源性表达,其长度约为18-25个核苷酸。人类基因中,mi RNA分子的占比仅仅为1%,却对1/3甚至更多的基因表达、修饰、翻译以及转录等发展过程发挥重要的调节作用。mi RNA,或可作为价值突出的分子标志物,为临床及早诊治恶性肿瘤、做好预后评估提供全新的方向。mi RNA-200家族,已是现代医学普遍关注的焦点。mi RNA-200家族有5个关键的成员:1)mi RNA-200a;2)mi RNA-200b;3)mi RNA-200c;4)mi RNA-141;5)mi RNA-429。该家族呈现出高保守性、较强的时序性、基因簇集性以及组织特异性等诸多特点。在肝癌以及肾细胞癌等多种恶性肿瘤中,该家族均有表达水平下调;然而,在膀胱癌、宫颈癌等恶性肿瘤中,则表达水平上调。已有研究证实,mi RNA-200家族中的5个成员间可协同作用也可单独作用,协同作用时能对ZEB1及ZEB2的表达水平进行调节,单独作用时,其5个成员还能发挥阻止EMT发生的作用。然而,在人类常见的恶性肿瘤中,该家族所担任的角色却尚未得到明确的研究结论。本研究通过实时定量PCR技术来对mi RNA-200家族中的热门基因mi RNA-141在结直肠癌以及癌旁正常两种组织中的表达水平进行检测,同时研究其表达水平和结直肠癌患者病理参数之间存在的关联。利用定量Real-time PCR检测mi RNA-141在人结直肠癌细胞株HT29细胞中的表达含量,通过瞬时转染法将mi RNA-141mimics或者是阴性对照分别转入到人结直肠癌细胞株HT29中,构建高表达mi RNA-141的模型;接着,利用MTT法来对肿瘤细胞的增殖状态进行检测,借助流式细胞仪对人结直肠癌细胞株HT29的周期变化进行分析,最后,通过细胞划痕实验来观察人结直肠癌细胞株HT29自身的迁移能力,分析mi RNA-141对结直肠癌细胞生物学行为的影响,从而为进一步阐明mi RNA-141在结直肠癌发生、演变中担任的角色提供理论依据。借助生物信息学软件初步预测mi RNA-141潜在可能的靶基因,之后进行潜在靶基因的筛选。最后在人结直肠癌细胞株HT29中,利用双萤光素酶报告基因系统来对靶基因进行验证,以期探讨该基因作为肿瘤标记物及抗肿瘤治疗靶点的可行性研究,希望能够为临床上的难题提供一些实验基础,为以后深入研究mi RNA-141的分子机制打下基础。第一部分 micro RNA-141在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性目的:探讨mi RNA-141在结直肠癌及其癌旁正常组织中不同的表达水平,探讨其表达水平和结直肠癌患者病理参数之间存在的关联。方法:收集结直肠癌患者58例术后的切除标本,通过定量Real-time PCR法来对结直肠癌以及癌旁正常两种组织中mi RNA-141的表达水平进行检测,通过t检验以及秩和检验进行统计学处理,探讨mi RNA-141的表达水平同结直肠癌患者病理参数存在的关联。结果:1结直肠癌组织以及癌旁正常组织中mi RNA-141的表达水平。通过定量Real-time PCR法来测定mi RNA-141在58例结直肠癌组织及与其配对的癌旁正常组织中的相对表达情况。结果显示58例结直肠癌病例癌组织中mi RNA-141的表达含量相较于癌旁正常组织明显下调,结果有统计学差异(Z值-6.314,P0.001),其中,mi RNA-141在84.48%(49/58)的癌组织中的表达相较于癌旁正常组织明显下调。2 mi RNA-141的表达水平和结直肠癌患者病理参数之间的关系。通过秩和检验,分析mi RNA-141的表达水平与结直肠癌患者各项临床病理参数之间的关联。结果显示:在58例结直肠癌癌组织中,mi RNA-141的检测水平和淋巴结有无转移以及肿瘤浸润深度之间有明显的相关性(P0.05),而与患者的性别、年龄、组织学分级、TNM分期、远处转移以及脉管瘤栓等因素,则未见明显的相关性(P0.05)。第二部分micro RNA-141对结直肠癌细胞生物学行为的影响及其机制研究目的:研究mi RNA-141对人结直肠癌胞株HT29细胞的增殖、周期以及迁移能力的影响。方法:运用定量Real-time PCR法来对3株结直肠癌细胞中各自的表达水平分别进行检测,选定体外细胞模型,转染mi RNA-141 mimics或者是阴性对照,构建高表达mi RNA-141的模型;之后,利用MTT法来对肿瘤细胞的增殖状态进行检测,借助流式细胞仪及划痕实验检测细胞周期及迁移能力,探讨结直肠癌细胞中mi RNA-141水平对细胞各种生物学行为的影响及其机制研究。结果:1 mi RNA-141在多株人结直肠癌细胞株中的表达水平。通过定量Real-time PCR分别对3株人结直肠癌细胞株(HCT8、HT29和HCT116)的mi RNA-141表达水平进行检测,并取癌旁正常组织检测值作为对照,由此表明:mi RNA-141在HCT8、HT29和HCT116这3株结直肠癌细胞中的表达水平均显著下调,降低的倍数依次为9.92倍、7.28倍以及2.95倍(P0.05)。2人结直肠癌细胞株HT29转染后mi RNA-141的表达水平。应用定量Real-time PCR法对成功转染了mi RNA-141 mimics以及阴性对照组的细胞中mi RNA-141的不同表达水平进行检测,结果显示:转染mi RNA-141mimics 48h后结直肠癌HT29细胞中mi RNA-141的表达水平相较于空白、阴性两个对照组均有明显的上调,平均上调倍数为10.5倍(P0.05)。这就说明:mi RNA-141 mimics已经成功地转染。3 mi RNA-141过表达对人结直肠癌细胞株HT29细胞增殖产生的影响。转染mi RNA-141以及阴性对照24h、48h以及72h三个时间点,通过MTT方法对HT29细胞实际的增殖状态分别作出检测,结果:转染24h、48h以及72h后,mi RNA-141 mimics实验组在各个时间点的OD值依次为0.307±0.010、0.361±0.015以及0.461±0.028;阴性对照组相应的OD值则分别为0.338±0.006、0.503±0.008以及0.774±0.011,不同时间点上,两组相比有统计学差异(P0.05)。利用OD值可以对细胞抑制率进行计算,mi RNA-141 mimics实验组在转染24h时的抑制率为10.70±1.87%,转染48h时的抑制率为30.34±1.25%,而在转染72h时的抑制率则为40.89±3.16%;阴性对照组,在不同时间点上的抑制率依次为1.59±1.18%、2.92±1.55%和0.86±0.37%,两组相比有明显的统计学差异(P0.05)。可见:结直肠癌细胞中的mi RNA-141水平升高,能对结直肠癌细胞的增殖起到较好的抑制作用。4 mi RNA-141过表达对人结直肠癌细胞株HT29细胞周期产生的影响。借助流式细胞仪来对mi RNA-141转染48h之后的HT29细胞周期作出检测,由此得知:转染48h后,mi RNA-141 mimics实验组在G1期、S期以及G2期这三个不同分期上的占比依次为73.77±0.84%、8.97±0.44%和18.46±1.39%,而阴性对照组三期的比例分别为42.11±0.81%、43.56±1.26%以及14.73±2.05%,其中,G1期、S期上两组相比有统计学差异(P0.05),G1期伴有明显的阻滞现象。这就提示:结直肠癌细胞中的mi RNA-141水平升高,或可对细胞由G1期发展为S期起到较好的阻滞和延缓作用。5 mi RNA-141过表达对人结直肠癌细胞株HT29细胞迁移能力产生的影响。利用细胞划痕实验来进行检验和分析,由此得知:转染24h后,mi RNA-141 mimics实验组在显微镜下观察到的迁移宽度为345.40±17.34μm,阴性对照组则为270.61±18.31μm,相比有统计学差异(P0.05)。提示:mi RNA-141过表达的结直肠癌细胞,其迁移能力相较于阴性对照组明显更低。第三部分micro RNA-141靶基因的验证及其机制研究目的:筛选和检验MAP4K4 m RNA可否作为mi RNA-141的靶基因,为探讨mi RNA-141有效的分子机制提供可靠的依据。方法:借助生物信息学软件来预测分析mi RNA-141的靶序列并进一步初筛靶基因;确定靶基因研究对象后,通过双萤光素酶报告基因法,进一步验证预测靶基因是否真实可靠。结果:1运用Micro RNA生物信息学网站和软件预测mi RNA-141靶基因。应用Target Scan、Pic Tar和mi Randa等诸多类型的生物信息学网站和软件进行初筛;具体结果:mi RNA-141位于人12号染色体,具体位置为12:6964097-6964191[+]。应用Target Scan、Pic Tar和mi Randa软件预测分析的mi RNA-141可能的靶基因数依次为1016、465和7721。本实验选取了近年来备受关注的MAP4K4基因(NM_004834)进行重点研究,得知3’UTR中可能存在和mi RNA-141之间进行结合的1段位点。结合该序列建立起报告载体,之后通过双萤光素酶报告基因法来对其作出进一步分析和验证。2经验证发现:MAP4K4可作为mi RNA-141的靶基因。我们利用“双萤光素酶报告基因系统”对MAP4K4究竟可否作为mi RNA-141的靶基因作出了有效验证。研究首先建立了MAP4K4 3’UTR以及突变型MAP4K43’UTR各自的表达载体;利用人结直肠细胞系HT29细胞作为模型,依次向人结直肠细胞系HT29细胞中共转染(1)MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141mimics;(2)MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141 NC;(3)MAP4K4 mut 3’UTR+mi RNA-141 mimics;(4)MAP4K4 mut 3’UTR+mi RNA-141 NC;划分为4个不同的实验小组;48h后可知:萤光素蛋白的表达水平有所下调的仅为MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141 mimics组(P0.05),说明mi RNA-141对MAP4K4 3’UTR报告基因的活性存在靶向抑制。然而,mi RNA-141却无法对MAP4K4 mut 3’UTR表达载体起到任何的抑制作用;mi RNA-141 NC同样也无法对MAP4K4 3’UTR表达载体和MAP4K4mut 3’UTR表达载体起到任何的抑制作用(P0.05)。本研究表明MAP4K4是mi RNA-141的靶基因,提示mi RNA-141对MAP4K4有显著的抑制功能。结论:1 mi RNA-141在结直肠癌患者癌组织中表达显著低于配对癌旁非癌组织,提示mi RNA-141可能不适合作为结直肠癌早期诊断的分子标志物,然而,上调mi RNA-141内源性表达水平,可能有助于临床防治结直肠癌,有望变成将来对结直肠癌进行诊治的分子靶标。2 mi RNA-141在癌组织中的低表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移情况有明显的相关,推测其在结直肠癌的发生、演变中发挥重要的作用。3 mi RNA-141在3株人结直肠癌细胞株HCT8、HT29和HCT116中的表达水平均有明显的下调,和结直肠癌组织检测情况相符。4 mi RNA-141在人结直肠癌细胞株HT29的过表达可对细胞增殖起到较好的抑制作用。说明mi RNA-141或可成为细胞增殖的重要的调控分子,从而作为临床对结直肠癌进行治疗的有效靶标。5 mi RNA-141在人结直肠癌细胞株HT29的过表达可阻滞肿瘤细胞由G1期发展为S期;故此推测:mi RNA-141或可对细胞周期存在影响,从而对细胞增殖发挥相应的抑制作用。6 mi RNA-141在人结直肠癌细胞株HT29的过表达可削弱细胞在体外所拥有的迁移能力。故此推测:mi RNA-141或可对细胞迁移存在影响,从而影响结直肠癌细胞的侵袭转移能力。7利用“双萤光素酶报告基因系统”验证了MAP4K4确可作为mi RNA-141有效的靶基因,说明mi RNA-141对MAP4K4存在抑制性功能的作用;mi RNA-141可能通过对MAP4K4的生物学功能加以抑制,从而对结直肠癌的发生、演变以及复发、转移等起到调节的作用,为临床继续探讨和明确mi RNA-141在结直肠癌中的分子机制提供有力的参考。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【参考文献】