Dicer通过调控PDIA3影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究
本文关键词： 上皮性卵巢癌 Dicer 双向电泳和液相色谱-串联质谱检测 PDIA3 microRNA 出处：《华中科技大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的RNAaseⅢ家族核糖核酸内切酶Dicer在上皮性卵巢癌中低表达并且与疾病的进展和生存期短相关。本研究旨在探究上皮性卵巢癌细胞中Dicer低表达所引起的蛋白组学改变,并寻找Dicer下游关键靶蛋白,以明确Dicer调控卵巢癌细胞恶性生物学行为的分子机制。方法1.构建特异性靶向沉默Dicer基因的短发卡RNA (shDicer)质粒,并连入慢病毒质粒载体。shDicer转染上皮性卵巢癌细胞A2780, CAOV3和SKOV3,构建稳定低表达Dicer的卵巢癌细胞转染株。2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测三组细胞系中Dicer表达的下调效率。EdU增殖实验,Wound-healing和Transwell迁移实验检测下调Dicer表达后,卵巢癌细胞的恶性增殖和迁移能力的变化。3.双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术检测上皮性卵巢癌细胞CAOV3-shNC和CAOV3-shDicer蛋白表达,并从中挑选出变化最为显著的蛋白点(表达差异大于2倍)使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测,同时利用qRT-PCR和WB对这些蛋白点的差异表达进行验证。基于差异表达,蛋白功能以及蛋白间相互作用分析,我们筛选出Dicer下游关键蛋白PDIA3。Targetscan软件预测,能够特异性结合并且调控PDIA3表达的microRNAs为miR-148a和miR-494,同时,qRT-PCR检测niR-148a和miR-494在Dicer低表达的细胞株中的表达水平。4.构建两个靶向沉默PDIA3基因的小干扰RNA (siRNA),转染稳定下调Dicer的上皮性卵巢癌细胞A2780、CAOV3和SKOV3。qRT-PCR和WB检测PDIA3的敲除效率。EdU增殖实验,Wound-healing和Transwell迁移实验分别检测下调PDIA3对Dicer沉默后引起卵巢癌细胞恶性增殖,迁移能力改变的影响。5.建立卵巢癌裸鼠皮下瘤模型,每组5只裸鼠,共五组。分别为SKOV3-shNC, SKOV3-shDicer、SKOV3-shDicer+siPDIA3-1、SKOV3-shDicer+siPDIA3-2和 SKOV3-shDicer+5%Glucose.每两天测量一次皮下瘤的大小并观察记录裸鼠一般情况(体重和饮食量)。6.裸鼠处死后,取出皮下瘤,一部分液氮保存,另一部分石蜡包埋。qRT-PCR和免疫组织化学法检测移植瘤中PDIA3、miR-148a和miR-494的表达量以及皮下瘤组织切片中增殖标志物Ki-67,肿瘤上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)途径上皮表型E-cadherin和间质表型Vimentin的表达水平。结果1. A2780, CAOV3和SKOV3转染shDicer后Dicer的mRNA水平和蛋白水平表达均下降了60-70%。与对照组(转染shNC的卵巢癌细胞)相比,稳定转染shDicer的卵巢癌细胞增殖和迁移能力均明显增强。2.双向电泳结果显示与CAOV3-shNC相比,CAOV3-shDicer细胞中的蛋白数量明显较多(294±7 VS 422±70,p=0.0132)。经过PDQuest软件分析后,挑选出表达量改变大于2倍蛋白中表达差异最明显的30个蛋白点做LC-MS/MS鉴定,除去未成功鉴定的和重复的蛋白点,最后共得到26个有意义的蛋白。3.String 10蛋白相互作用分析数据库和DAVID蛋白功能分析网站解析了26个蛋白点与Dicer之间的相互关系；最终挑选出了7个与Dicer存在相互作用并且在卵巢癌生物学进展中起着重要作用的靶蛋白。qRT-PCR和WB进一步验证了在下调Dicer的三株卵巢癌细胞中这7个靶蛋白的表达量改变,经过对蛋白表达量的变化和蛋白功能的分析,我们得出PDIA3蛋白最有可能成为Dicer下游的关键靶蛋白,并且沉默Dicer表达后,卵巢癌细胞A2780,CAOV3和SKOV3中PDIA3的表达水平升高,而miR-148a和miR-494的表达显著降低。4.沉默PDIA3表达后,下调Dicer的卵巢癌细胞A2780,CAOV3和SKOV3的增殖和迁移能力受到明显抑制。裸鼠在体试验显示下调Dicer的卵巢癌细胞组移植瘤体积明显大于相应对照组,同时转染了siPDIA3的低表达Dicer卵巢癌细胞组移植瘤的体积明显小于对照的低表达Dicer细胞组。5.qRT-PCR和免疫组织化学法结果显示Dicer低表达组中PDIA3表达水平升高,miR-148a和miR-494的表达水平降低；同时增殖标志物Ki-67的表达信号增强,EMT途径相关上皮表型E-cadherin表达显著降低而间质表型Vimentin的表达明显增多；同时转染siPDIA3的低表达Dicer组中,Dicer下调的卵巢癌细胞移植瘤中PDIA3表达量减少,同时增殖标志物Ki-67的表达水平也降低,EMT途径间质表型Vimentin表达降低,而上皮表型E-cadherin表达水平获得升高。结论低表达Dicer通过影响nicroRNAs的表达,介导PDIA3表达上调从而促进了上皮性卵巢癌细胞恶性增殖和迁移行为。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of dicer in epithelial ovarian cancer cell line by double - dimensional electrophoresis ( RT - PCR ) and Western blot ( WB ) . Compared with the control group ( transfected with shNC ovarian cancer cells ) , the proliferation and migration of ovarian cancer cells stably transfected with shDicer were significantly increased . The expression level of PDIA3 in ovarian cancer cells was significantly lower than that of control group . The expression level of PDIA3 in ovarian cancer cells was significantly lower than that of control group .
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
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，本文编号：1498218
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